Erläuterung grundlegender molekularbiologischer Begriffe
1. cDNA und cccDNA: cDNA ist eine doppelsträngige DNA, die durch Reverse Transkriptase aus mRNA synthetisiert wird;cccDNA ist eine doppelsträngige, geschlossene, zirkuläre Plasmid-DNA, die frei vom Chromosom ist.
2. Standardfaltungseinheit: Die Protein-Sekundärstruktureinheit α-Helix und β-Faltblatt kann durch verschiedene verbindende Polypeptide Strukturblöcke mit speziellen geometrischen Anordnungen bilden.Diese Art der bestimmten Faltung wird üblicherweise als Supersekundärstruktur bezeichnet.Nahezu alle Tertiärstrukturen können durch diese Faltungstypen beschrieben werden, und sogar ihre kombinierten Typen werden daher auch als Standardfaltungseinheiten bezeichnet.
3. CAP: zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP)-Rezeptorprotein CRP (cAMP-Rezeptorprotein). Der nach der Kombination von cAMP und CRP gebildete Komplex wird als aktivierendes Protein CAP (cAMP-aktiviertes Protein) bezeichnet.
4. Palindromische Sequenz: Die umgekehrte komplementäre Sequenz eines Segments eines DNA-Fragments, häufig einer Restriktionsenzymstelle.
5. micRNA: Komplementäre interferierende RNA oder Antisense-RNA, die zur mRNA-Sequenz komplementär ist und die Translation von mRNA hemmen kann.
6. Ribozym: RNA mit katalytischer Aktivität, die eine autokatalytische Rolle beim Spleißprozess der RNA spielt.
7. Motiv: In der räumlichen Struktur von Proteinmolekülen gibt es einige lokale Regionen mit ähnlicher dreidimensionaler Form und Topologie
8. Signalpeptid: ein Peptid mit 15–36 Aminosäureresten am N-Terminus während der Proteinsynthese, das die Transmembran des Proteins steuert.
9. Attenuator: Eine Nukleotidsequenz zwischen einer Operatorregion und einem Strukturgen, das die Transkription beendet.
10. Magic Spot: Wenn das Bakterium wächst und einen völligen Mangel an Aminosäuren feststellt, reagiert das Bakterium mit einer Notfallreaktion und stoppt die Expression aller Gene.Die Signale, die diese Notfallreaktion auslösen, sind Guanosintetraphosphat (ppGpp) und Guanosinpentaphosphat (pppGpp).Die Rolle von PpGpp und pppGpp besteht nicht nur bei einem oder einigen wenigen Operons, sondern betrifft eine große Anzahl von ihnen, weshalb sie als Superregulatoren oder magische Flecken bezeichnet werden.
11. Upstream-Promotorelement: Bezieht sich auf die DNA-Sequenz, die eine regulatorische Rolle bei der Aktivität des Promotors spielt, wie z. B. TATA in der -10-Region, TGACA in der -35-Region, Enhancer und Attenuatoren.
12. DNA-Sonde: ein markierter DNA-Abschnitt mit einer bekannten Sequenz, der häufig zum Nachweis unbekannter Sequenzen und zum Screening von Zielgenen verwendet wird.
13. SD-Sequenz: Es handelt sich um die Bindungssequenz von Ribosom und mRNA, die die Translation reguliert.
14. Monoklonaler Antikörper: Ein Antikörper, der nur gegen eine einzelne antigene Determinante wirkt.
15. Cosmid: Es handelt sich um einen künstlich konstruierten exogenen DNA-Vektor, der die COS-Regionen an beiden Enden des Phagen behält und mit dem Plasmid verbunden ist.
16. Blau-Weiß-Spot-Screening: LacZ-Gen (kodiert für β-Galactosidase), das Enzym kann das chromogene Substrat X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indol-β-D-galactosid) zersetzen, um Blau zu erzeugen, wodurch der Stamm blau wird.Wenn die exogene DNA eingefügt wird, kann das LacZ-Gen nicht exprimiert werden und der Stamm ist weiß, um die rekombinanten Bakterien zu screenen.Dies wird als Blau-Weiß-Rasterung bezeichnet.
17. Cis-wirkendes Element: Eine spezifische Basensequenz in der DNA, die die Genexpression reguliert.
18. Klenow-Enzym: Großes Fragment der DNA-Polymerase I, außer dass die 5'-3'-Exonukleaseaktivität vom Holoenzym der DNA-Polymerase I entfernt wurde
19. Verankerte PCR: Wird zur Amplifikation der interessierenden DNA mit einer bekannten Sequenz an einem Ende verwendet.An einem Ende der unbekannten Sequenz wurde ein Poly-dG-Schwanz hinzugefügt, und dann wurden das Poly-dC und die bekannte Sequenz als Primer für die PCR-Amplifikation verwendet.
20. Fusionsprotein: Das Gen des eukaryotischen Proteins ist mit dem exogenen Gen verbunden, und das Protein, das aus der Übersetzung des ursprünglichen Genproteins und des exogenen Proteins besteht, wird gleichzeitig exprimiert.
Andere molekularbiologische Begriffe
1. Die physikalische Karte der DNA ist die Reihenfolge, in der die (durch Restriktionsendonuklease verdauten) Fragmente des DNA-Moleküls angeordnet sind.
2. Die Spaltung von RNase wird in zwei Arten (Autokatalyse) und (Heterokatalyse) unterteilt.
3. Es gibt drei Initiationsfaktoren in Prokaryoten: (IF-1), (IF-2) und (IF-3).
4. Transmembranproteine benötigen Führung (Signalpeptide), und die Rolle von Protein-Chaperonen besteht darin (hilft dabei, die Peptidkette in die native Konformation des Proteins zu falten).
5. Elemente in Promotoren können im Allgemeinen in zwei Typen unterteilt werden: (Kern-Promoterelemente) und (Upstream-Promoterelemente).
6. Der Forschungsinhalt der Molekularbiologie umfasst hauptsächlich drei Teile: (strukturelle Molekularbiologie), (Genexpression und -regulation) und (DNA-Rekombinationstechnologie).
7. Die beiden wichtigsten Experimente, die zeigen, dass DNA das genetische Material ist, sind (Pneumokokken-Infektion von Mäusen) und (T2-Phagen-Infektion von Escherichia coli).Potenzial).
8. Es gibt zwei Hauptunterschiede zwischen hnRNA und mRNA: (hnRNA wird bei der Umwandlung in mRNA gespleißt), (das 5'-Ende der mRNA wird mit einer m7pGppp-Kappe versehen, und am 3'-Ende des mRNA-Säureschwanzes (polyA) findet eine zusätzliche Polyadenylierung statt).
9. Die Vorteile der Multi-Untereinheiten-Form des Proteins sind (Untereinheit ist eine wirtschaftliche Methode zur DNA-Nutzung), (kann den Einfluss zufälliger Fehler in der Proteinsynthese auf die Proteinaktivität reduzieren), (Aktivität kann sehr effizient und schnell geöffnet und geschlossen werden).
10. Der Hauptinhalt der ersten Nukleationstheorie des Proteinfaltungsmechanismus umfasst (Nukleation), (strukturelle Anreicherung) und (endgültige Umlagerung).
11. Galaktose hat eine doppelte Wirkung auf Bakterien;Einerseits (kann als Kohlenstoffquelle für das Zellwachstum genutzt werden);andererseits (es ist auch Bestandteil der Zellwand).Daher wird für die permanente Synthese auf Hintergrundebene ein cAMP-CRP-unabhängiger Promotor S2 benötigt;Gleichzeitig wird ein cAMP-CRP-abhängiger Promotor S1 benötigt, um die Synthese auf hohem Niveau zu regulieren.Die Transkription beginnt bei (S2) mit G und bei (S1) ohne G.
12. Die rekombinante DNA-Technologie wird auch als (Genklonen) oder (molekulares Klonen) bezeichnet.Das ultimative Ziel besteht darin, die genetische Information DNA in einem Organismus auf einen anderen Organismus zu übertragen.Ein typisches DNA-Rekombinationsexperiment umfasst normalerweise die folgenden Schritte: (1) Extrahieren des Zielgens (oder exogenen Gens) des Spenderorganismus und dessen enzymatische Verknüpfung mit einem anderen DNA-Molekül (Klonierungsvektor), um ein neues rekombinantes DNA-Molekül zu bilden.② Das rekombinante DNA-Molekül wird in die Empfängerzelle übertragen und in der Empfängerzelle repliziert.Dieser Vorgang wird Transformation genannt.③ Durchsuchen und identifizieren Sie die Empfängerzellen, die die rekombinante DNA absorbiert haben.④Kultivieren Sie die Zellen, die rekombinante DNA in großen Mengen enthalten, um festzustellen, ob das Foreign-Aid-Gen exprimiert wird.
13. Es gibt zwei Arten der Plasmidreplikation: diejenigen, die streng durch die Proteinsynthese der Wirtszelle kontrolliert werden, werden als (dichte Plasmide) bezeichnet, und solche, die nicht streng durch die Proteinsynthese der Wirtszelle kontrolliert werden, werden als (entspannte Plasmide) bezeichnet.
14. Das PCR-Reaktionssystem sollte die folgenden Bedingungen erfüllen: a.DNA-Primer (ca. 20 Basen) mit komplementären Sequenzen an jedem Ende der beiden zu trennenden Stränge des Zielgens.B.Enzyme mit thermischer Stabilität wie: TagDNA-Polymerase.c, dNTPd, interessierende DNA-Sequenz als Matrize
15. Der grundlegende Reaktionsprozess der PCR umfasst drei Stufen: (Denaturierung), (Annealing) und (Verlängerung).
16. Der grundlegende Prozess transgener Tiere umfasst normalerweise: ①Einführung eines geklonten Fremdgens in den Kern einer befruchteten Eizelle oder einer embryonalen Stammzelle;②Transplantation der inokulierten befruchteten Eizelle oder embryonalen Stammzelle in die weibliche Gebärmutter;③Vollständige Embryonalentwicklung und Wachstum Für die Nachkommen mit fremden Genen;④ Verwenden Sie diese Tiere, die fremde Proteine produzieren können, als Zuchttiere, um neue homozygote Linien zu züchten.
17. Hybridomzelllinien werden durch Hybridisierung von (Milz-B-)Zellen mit (Myelom-)Zellen erzeugt, und da (Milzzellen) Hypoxanthin nutzen können und (Knochenzellen) Zellteilungsfunktionen bereitstellen, können sie in HAT-Medium gezüchtet werden.wachsen.
18. Mit der Vertiefung der Forschung wird die erste Generation von Antikörpern (polyklonale Antikörper), die zweite Generation (monoklonale Antikörper) und die dritte Generation (gentechnische Antikörper) genannt.
19. Gegenwärtig konzentriert sich die Gentechnik von Insektenviren hauptsächlich auf Baculoviren, was sich in der Einführung von (exogenem Toxin-Gen) manifestiert;(Gene, die den normalen Lebenszyklus von Insekten stören);(Modifikation von Virusgenen).
20. Die transaktiven Proteinfaktoren, die den gemeinsamen Elementen TATA, GC und CAAT im Säugetier-RNA-Polymerase-II-Promotor entsprechen, sind (TFIID), (SP-1) bzw. (CTF/NF1).
einundzwanzig.Die grundlegenden Transkriptionsfaktoren der RNA-Polymerase Ⅱ sind TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E und ihre Bindungssequenz ist: (D, A, B, E).Wobei die Funktion von TFII-D darin besteht (Bindung an die TATA-Box).
zweiundzwanzig.Die meisten Transkriptionsfaktoren, die an DNA binden, wirken in Form von Dimeren.Die funktionellen Domänen von Transkriptionsfaktoren, die an DNA binden, sind üblicherweise die folgenden (Helix-Turn-Helix), (Zinkfinger-Motiv), (basisches Leucin) Reißverschluss-Motiv).
23.Es gibt drei Arten von Restriktionsendonuklease-Spaltungsmodi: (Schnitt an der 5'-Seite der Symmetrieachse, um 5'-klebende Enden zu erzeugen), (Schnitt an der 3'-Seite der Symmetrieachse, um 3'-klebrige Enden zu erzeugen (Schnitt an der Symmetrieachse, um flache Segmente zu erzeugen)).
vierundzwanzig.Plasmid-DNA hat drei verschiedene Konfigurationen: (SC-Konfiguration), (oc-Konfiguration), (L-Konfiguration).Die erste in der Elektrophorese ist (SC-Konfiguration).
25. Exogene Genexpressionssysteme, hauptsächlich (Escherichia coli), (Hefe), (Insekt) und (Säugetierzelltabelle).
26. Die bei transgenen Tieren üblicherweise verwendeten Methoden sind: (retrovirale Infektionsmethode), (DNA-Mikroinjektionsmethode), (embryonale Stammzellenmethode).
Anwendung Molekularbiologie
1. Nennen Sie die Funktionen von mehr als 5 RNAs?
Transfer-RNA tRNA Transfer-Aminosäure Ribosom-RNA rRNA Ribosom stellt Boten-RNA dar mRNA Proteinsynthese-Vorlage Heterogene Kern-RNA hnRNA Vorläufer der reifen mRNA kleine Kern-RNA snRNA Beteiligt am hnRNA-Spleißen Kleine zytoplasmatische RNA scRNA/7SL-RNA-Protein Plasma-Retikulum-lokalisierte und synthetisierte Signalerkennungskörperkomponenten Antisense-RNA anRNA/micRNA Reguliert die Genexpression Ribozym-RNA enzymatisch aktive RNA
2. Was ist der Hauptunterschied zwischen prokaryotischen und eukaryotischen Promotoren?
Prokaryotischer TTGACA --- TATAAT------Initiation Site-35 -10 Eukaryotischer Enhancer---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Initiation Site-110 -70 -25
3. Was sind die Hauptaspekte der künstlichen Konstruktion natürlicher Plasmide?
Natürliche Plasmide weisen häufig Defekte auf, sind daher nicht als Träger für die Gentechnik geeignet und müssen modifiziert und konstruiert werden: a.Fügen Sie geeignete Selektionsmarkergene hinzu, z. B. zwei oder mehr, die einfach für die Selektion verwendet werden können, normalerweise Antibiotika-Gene.B.Erhöhen oder verringern Sie geeignete Enzymschnittstellen, um die Rekombination zu erleichtern.C.Verkürzen Sie die Länge, schneiden Sie unnötige Fragmente ab, verbessern Sie die Importeffizienz und erhöhen Sie die Ladekapazität.D.Ändern Sie das Replikon von „Tight“ zu „Loose“, von weniger Kopien zu mehr Kopien.e.Fügen Sie spezielle genetische Elemente entsprechend den besonderen Anforderungen der Gentechnik hinzu
4. Nennen Sie ein Beispiel für eine Methode zum differenziellen Screening gewebespezifischer cDNA?
Es werden zwei Zellpopulationen hergestellt, das Zielgen wird in einer der Zellen exprimiert oder stark exprimiert und das Zielgen wird in der anderen Zelle nicht oder nur schwach exprimiert, und dann wird das Zielgen durch Hybridisierung und Vergleich gefunden.Beispielsweise präsentieren Tumorzellen während des Auftretens und der Entwicklung von Tumoren mRNAs mit anderen Expressionsniveaus als normale Zellen.Daher können tumorbezogene Gene durch differenzielle Hybridisierung herausgesucht werden.Die Induktionsmethode kann auch zum Screening der Gene verwendet werden, deren Expression induziert wird.
5. Erzeugung und Screening von Hybridomzelllinien?
Milz-B-Zellen + Myelomzellen, fügen Sie Polyethylenglykol (PEG) hinzu, um die Zellfusion zu fördern, und die in HAT-Medium (enthaltend Hypoxanthin, Aminopterin, T) gezüchteten Milz-B-Myelom-Fusionszellen wachsen weiter und ernähren sich.Die Zellfusion enthält: Milz-Milz-Fusionszellen: nicht wachstumsfähig, Milzzellen können nicht in vitro kultiviert werden.Knochen-Knochen-Fusionszellen: können Hypoxanthin nicht verwerten, können aber Purin über den zweiten Weg mithilfe von Folatreduktase synthetisieren.Aminopterin hemmt die Folatreduktase und kann daher nicht wachsen.Knochen-Milz-Fusionszellen: können in HAT wachsen, Milzzellen können Hypoxanthin nutzen und Knochenzellen übernehmen die Funktion der Zellteilung.
6. Was ist das Prinzip und die Methode zur Bestimmung der Primärstruktur der DNA mit der Didesoxy-Terminierungsmethode (Sanger-Methode)?
Das Prinzip besteht darin, einen Nukleotidkettenterminator – 2,3-Didesoxynukleotid – zu verwenden, um die Verlängerung der DNA zu beenden.Da ihm das für die Bildung von 3/5/Phosphodiester-Bindungen erforderliche 3-OH fehlt, kann die DNA-Kette nach dem Einbau in die DNA-Kette nicht weiter verlängert werden.Nach dem Prinzip der Basenpaarung gibt es immer dann, wenn die DNA-Polymerase dNMP benötigt, um an der normalerweise verlängerten DNA-Kette teilzunehmen, zwei Möglichkeiten: Die eine besteht darin, an ddNTP teilzunehmen, was zur Beendigung der Verlängerung der Desoxynukleotidkette führt;Die andere besteht darin, an dNTP teilzunehmen, sodass die DNA-Kette noch weiter verlängert werden kann, bis das nächste ddNTP eingebaut wird.Nach dieser Methode kann eine Gruppe von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge mit der Endung ddNTP erhalten werden.Die Methode besteht darin, sie in vier Gruppen zu unterteilen: ddAMP, ddGMP, ddCMP und ddTMP.Nach der Reaktion kann die Polyacrylamid-Gelelektrophorese die DNA-Sequenz anhand der Schwimmbänder ablesen.
7. Welche positive Regulationswirkung hat das Aktivatorprotein (CAP) auf die Transkription?
Zyklisches Adenylat (cAMP)-Rezeptorprotein CRP (cAMP-Rezeptorprotein), der durch die Kombination von cAMP und CRP gebildete Komplex wird CAP (cAMPaktiviertes Protein) genannt.Wenn E. coli in einem Medium ohne Glucose gezüchtet wird, erhöht sich die Synthese von CAP, und CAP hat die Funktion, Promotoren wie Laktose (Lac) zu aktivieren.Einigen CRP-abhängigen Promotoren fehlt das typische Sequenzmerkmal der -35-Region (TTGACA), das gewöhnliche Promotoren aufweisen.Daher ist es für die RNA-Polymerase schwierig, daran zu binden.Das Vorhandensein von CAP (Funktion): kann die Bindungskonstante von Enzym und Promotor deutlich verbessern.Es zeigt hauptsächlich die folgenden zwei Aspekte: ① CAP hilft dem Enzymmolekül, sich richtig auszurichten, indem es die Konformation des Promotors und die Wechselwirkung mit dem Enzym ändert, um sich mit der -10-Region zu verbinden und die Rolle des Ersetzens der Funktion der -35-Region zu spielen.②CAP kann auch die Bindung der RNA-Polymerase an andere Stellen in der DNA hemmen und dadurch die Wahrscheinlichkeit der Bindung an ihren spezifischen Promotor erhöhen.
8. Welche Schritte sind normalerweise in einem typischen DNA-Rekombinationsexperiment enthalten?
A.Extrahieren Sie das Zielgen (oder exogene Gen) des Spenderorganismus und verbinden Sie es enzymatisch mit einem anderen DNA-Molekül (Klonierungsvektor), um ein neues rekombinantes DNA-Molekül zu bilden.B.Übertragen Sie das rekombinante DNA-Molekül in die Empfängerzelle und replizieren und bewahren Sie es in der Empfängerzelle.Dieser Vorgang wird Transformation genannt.C.Durchsuchen und identifizieren Sie die Empfängerzellen, die die rekombinante DNA absorbiert haben.D.Massenkultivieren Sie die Zellen, die die rekombinante DNA enthalten, um festzustellen, ob das Foreign-Aid-Gen exprimiert wird.
9. Aufbau einer Genbibliothek Es werden drei Methoden zum Screening von Rekombinanten vorgestellt und der Prozess kurz beschrieben.
Antibiotikaresistenz-Screening, Insertionsinaktivierung der Resistenz, Blue-White-Spot-Screening oder PCR-Screening, Differential-Screening, DNA-Sonde. Die meisten Klonierungsvektoren tragen Antibiotikaresistenzgene (Anti-Ampicillin, Tetracyclin).Wenn das Plasmid in Escherichia coli übertragen wird, entwickeln die Bakterien eine Resistenz, und diejenigen ohne Übertragung werden keine Resistenz aufweisen.Es kann jedoch nicht unterscheiden, ob eine Umstrukturierung erfolgt ist oder nicht.Wenn in einem Vektor, der zwei Resistenzgene enthält, ein fremdes DNA-Fragment in eines der Gene eingefügt wird und das Gen inaktiviert, können zwei Plattenkontrollen mit unterschiedlichen Arzneimitteln zum Screening auf positive Rekombinanten verwendet werden.Beispielsweise enthält das pUC-Plasmid das LacZ-Gen (kodierend für β-Galactosidase), das das chromogene Substrat X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indol-β-D-galactosid) abbauen kann, um Blau zu erzeugen, wodurch der Stamm blau wird.Wenn die fremde DNA eingefügt wird, kann das LacZ-Gen nicht exprimiert werden und der Stamm ist weiß, um die rekombinanten Bakterien zu screenen.
10. Erklären Sie den grundlegenden Prozess der Gewinnung transgener Tiere durch embryonale Stammzellen?
Embryonale Stammzellen (ES) sind embryonale Zellen während der Embryonalentwicklung, die künstlich kultiviert und vermehrt werden können und die Funktion haben, sich in andere Zelltypen zu differenzieren.Kultur von ES-Zellen: Die innere Zellmasse der Blastozyste wird isoliert und kultiviert.Wenn ES in einer Feeder-freien Schicht kultiviert wird, differenziert es sich in verschiedene funktionelle Zellen wie Muskelzellen und N-Zellen.Bei Kultivierung in einem Medium, das Fibroblasten enthält, behält ES die Differenzierungsfunktion bei.ES kann genetisch manipuliert werden und seine Differenzierungsfunktion kann integriert werden, ohne seine Differenzierungsfunktion zu beeinträchtigen, wodurch das Problem der zufälligen Integration gelöst wird.Führen Sie exogene Gene in embryonale Stammzellen ein, implantieren Sie sie dann in die Gebärmutter schwangerer weiblicher Mäuse, entwickeln Sie sie zu Welpen und kreuzen Sie sie, um homozygote Mäuse zu erhalten.
