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Das herausragende Merkmal der PCR-Reaktion ist ihre große Amplifikationskapazität und extrem hohe Empfindlichkeit.Um die PCR-Leistung und die Nachweiseffizienz zu verbessern, sind wir bestrebt, die PCR-Amplifikationskapazität und die Nachweisempfindlichkeit zu verbessern, aber das Problem liegt im Verlauf des Experiments.Es kommt häufig zu falsch positiven Ergebnissen, und eine sehr geringe Menge an Probenkreuzkontaminationen oder PCR-Produktkontaminationen kann zu falsch positiven Ergebnissen im Experiment führen.

Fünf Arten der PCR-Produktkontamination

Es gibt viele Gründe für eine PCR-Kontamination, die sich grob in die folgenden Kategorien einteilen lassen:

1. Kreuzkontamination zwischen Proben

1.1

Eine Probenkontamination wird hauptsächlich durch die Kontamination des Behälters zum Sammeln der Probe verursacht. Wenn die Probe platziert wird, tritt sie aufgrund einer losen Versiegelung aus dem Behälter aus oder die Probe haftet an der Außenseite des Behälters, was zu einer Kreuzkontamination führt.Eine Kontamination führt zu einer Kontamination zwischen den Proben;Einige mikrobielle Proben, insbesondere Viren, können sich mit Aerosolen verbreiten oder Aerosole bilden, was zu einer gegenseitigen Kontamination führt.

2. Kontamination mit PCR-Reagenzien

Der Hauptgrund dafür ist, dass während der Vorbereitung der PCR-Reagenzien die Probenpistole, der Behälter, doppelt destilliertes Wasser und andere Lösungen durch die PCR-Nukleinsäurevorlage kontaminiert werden.

1.2

3.Kontamination durch Klonierungsplasmide

1.3

In molekularbiologischen Laboren und einigen Laboren, die geklonte Plasmide als Positivkontrollen verwenden, ist das Problem der Kontamination mit geklonten Plasmiden ebenfalls häufig.Da der Gehalt an Klonierungsplasmid pro Volumeneinheit ziemlich hoch ist und für den Reinigungsprozess mehr Werkzeuge und Reagenzien benötigt werden, ist es sehr wahrscheinlich, dass das Plasmid in lebenden Zellen aufgrund der starken Wachstums- und Reproduktionsfähigkeit lebender Zellen kontaminiert wird.

4.Kontamination amplifizierter Produkte

Die Kontamination amplifizierter Produkte ist das häufigste Kontaminationsproblem bei PCR-Reaktionen.Da die Kopienmenge des PCR-Produkts groß ist (im Allgemeinen 1013 Kopien/ml), was weit über der Grenze der PCR-Nachweiskopienzahl liegt, kann eine sehr geringe Menge an PCR-Produktkontamination zu falsch positiven Ergebnissen führen.

1.4

5.Aerosolverschmutzung

1.5

Aerosolverschmutzung ist die wahrscheinlichste Form der Kontamination von PCR-Produkten und kann auch am leichtesten übersehen werden.Es entsteht durch die Reibung zwischen der Flüssigkeitsoberfläche und der Luft.Im Allgemeinen kann es beim Öffnen des Deckels, beim Ansaugen der Probe oder sogar beim kräftigen Schütteln des Reaktionsgefäßes zu einer Aerosolkontamination kommen.Berechnungen zufolge kann ein Aerosolpartikel 48.000 Exemplare enthalten, sodass die dadurch verursachte Verschmutzung ein Problem darstellt, das besondere Aufmerksamkeit verdient.

Insbesondere Testlabore verwenden häufig dasselbe Primerpaar, um ein bestimmtes Gen zu testen.Im Laufe der Zeit wird es im Laborraum zu einer großen Kontamination mit PCR-Produkten kommen.Sobald eine solche Kontamination auftritt, ist es schwierig, sie in kurzer Zeit zu beseitigen.

Für die ersten drei Arten von Verschmutzung können wir wirksame Mittel zur Vermeidung einsetzen, die Verschmutzung durch PCR-Produkte ist jedoch schwer zu verhindern, insbesondere beim Bau von nicht standardmäßigen PCR-Laboren.Beim PCR-Prozess entsteht ein Aerosol, wenn die Pipettenspitze die Flüssigkeit ansaugt und ausbläst und der Deckel des PCR-Röhrchens geöffnet wird.Die vom Aerosol getragenen DNA-Moleküle (ein Aerosol kann Zehntausende DNA tragen) sind schwer zu beseitigen, da sie in der Luft schweben.Sobald die nächste Runde von PCR-Experimenten eingeführt wird, wird es unweigerlich zu falsch positiven Ergebnissen kommen.

Wie in der folgenden Abbildung dargestellt, verstärkte die Negativkontrolle auch die entsprechende interessierende Bande:

1.6

Der erste Teil dieser Ausgabe zum Thema PCR-Verschmutzung und -Prävention wird hier vorgestellt.In der nächsten Ausgabe erwartet Sie der zweite Teil „Prävention von PCR-Produktkontaminationen“, also bleiben Sie dran!


Zeitpunkt der Veröffentlichung: 25. Juli 2017