In den letzten zehn Jahren hat sich die auf CRISPR basierende Genbearbeitungstechnologie rasant weiterentwickelt und wurde in klinischen Studien am Menschen erfolgreich zur Behandlung genetischer Krankheiten und Krebs eingesetzt.Gleichzeitig erschließen Wissenschaftler auf der ganzen Welt ständig neue Werkzeuge mit Gen-Editing-Potenzial, um die Probleme bestehender Gen-Editing-Tools und -Entscheidungen zu lösen.

Im September 2021 veröffentlichte das Team von Zhang Feng einen Artikel im Science Journal [1] und stellte fest, dass eine Vielzahl von Transpostern RNA-gesteuerte Nukleinsäureenzyme kodierten, und nannte es Omega-System (einschließlich ISCB, ISRB, TNP8).Die Studie ergab auch, dass das Omega-System einen Abschnitt der RNA verwendet, um die schneidende DNA-Doppelkette zu steuern, nämlich die ωRNA.Noch wichtiger ist, dass diese Nukleinsäureenzyme sehr klein sind und nur etwa 30 % von CAS9 ausmachen, was bedeutet, dass sie möglicherweise eher an Zellen abgegeben werden.

Am 12. Oktober 2022 veröffentlichte das Team von Zhang Feng in der Zeitschrift Nature den Titel: Structure of the Omega Nickase ISRB in Complex with ωrna and Target DNA [2].

Die Studie analysierte außerdem die elektronenmikroskopische Struktur der ISRB-ωRNA und des Ziel-DNA-Komplexes im Omega-System.

ISCB ist der Vorfahre von CAS9, und ISRB ist das gleiche Objekt, da die HNH-Nukleinsäuredomäne von ISCB fehlt. Daher ist die Größe kleiner und beträgt nur etwa 350 Aminosäuren.DNA bildet auch die Grundlage für die weitere Entwicklung und den technischen Wandel.

RNA-gesteuertes IsrB ist ein Mitglied der OMEGA-Familie, das von der Transposon-Superfamilie IS200/IS605 kodiert wird.Aufgrund der phylogenetischen Analyse und der gemeinsamen einzigartigen Domänen ist IsrB wahrscheinlich der Vorläufer von IscB, dem Vorfahren von Cas9.

Im Mai 2022 veröffentlichte das Lovely Dragon Laboratory der Cornell University einen Artikel in der Zeitschrift Science [3], in dem die Struktur von IscB-ωRNA und ihr Mechanismus zum Schneiden von DNA analysiert wurden.

Im Vergleich zu IscB und Cas9 fehlen IsrB die HNH-Nukleasedomäne, der REC-Lappen und die meisten mit der PAM-Sequenz interagierenden Domänen, sodass IsrB viel kleiner als Cas9 ist (nur etwa 350 Aminosäuren).Allerdings wird die geringe Größe von IsrB durch eine relativ große Guide-RNA ausgeglichen (seine Omega-RNA ist etwa 300 nt lang).

Zhang Fengs Team analysierte die Kryo-Elektronenmikroskop-Struktur von IsrB (DtIsrB) aus dem bei feuchter Hitze anaeroben Bakterium Desulfovirgula thermocuniculi und seinem Komplex aus ωRNA und Ziel-DNA.Die Strukturanalyse zeigte, dass die Gesamtstruktur des IsrB-Proteins eine gemeinsame Grundgerüststruktur mit dem Cas9-Protein aufweist.

Der Unterschied besteht jedoch darin, dass Cas9 den REC-Lappen nutzt, um die Zielerkennung zu erleichtern, während IsrB auf seine ωRNA angewiesen ist, von der ein Teil eine komplexe dreidimensionale Struktur bildet, die wie REC wirkt.

Um die strukturellen Veränderungen von IsrB und Cas9 während der Evolution von RuvC besser zu verstehen, verglich Zhang Fengs Team die Ziel-DNA-Bindungsstrukturen von RuvC (TtRuvC), IsrB, CjCas9 und SpCas9 von Thermus thermophilus.

Die Strukturanalyse von IsrB und seiner ωRNA verdeutlicht, wie IsrB-ωRNA gemeinsam Ziel-DNA erkennt und spaltet, und bietet außerdem eine Grundlage für die weitere Entwicklung und Konstruktion dieser miniaturisierten Nuklease.Vergleiche mit anderen RNA-gesteuerten Systemen verdeutlichen funktionelle Wechselwirkungen zwischen Proteinen und RNAs und erweitern unser Verständnis der Biologie und Evolution dieser verschiedenen Systeme.

Links:

1.https://www.science.org/doi/10.1126/science.abj6856

2.https://www.science.org/doi/10.1126/science.abq7220

3.https://www.nature.com/articles/s41586-022-05324-6