Im Frühstadium des Ausbruchs ist aufgrund der schnellen Entwicklung eine schnelle Diagnose verdächtiger Patienten der Schlüssel zur Vorbeugung von COVID-19.Einige zugelassene Nukleinsäure-Nachweisreagenzien haben eine kurze Entwicklungszeit und es gibt Probleme wie eine überstürzte Leistungsbestätigung, eine unzureichende Reagenzoptimierung und große Unterschiede zwischen den Chargen;Die Probleme verschiedener klinischer Labore in verschiedenen Aspekten des Nukleinsäure-Nachweisprozesses können sich auch auf die Genauigkeit der Nukleinsäure-Nachweisergebnisse auswirken.Dieser Artikel konzentriert sich auf die wichtigsten Zusammenhänge und Punkte beim aktuellen SARS-CoV-2-Nukleinsäurenachweis und analysiert die Probleme falsch negativer und positiver erneuter Untersuchungen des Nukleinsäurenachweises im Labor sowie klinische Inkonsistenzen.

Prinzipien des SARS-CoV-2-Nukleinsäurenachweises

SARS-CoV-2 ist ein RNA-Virus mit einer Genomsequenz von etwa 29 kb und 10 Genen, die effektiv 10 Proteine ​​kodieren können.Viren bestehen aus RNA und Proteinen, und die äußerste Schicht ist eine äußere Hülle aus Lipiden und Glykoproteinen.Im Inneren umhüllt das Proteinkapsid die RNA und schützt so die leicht abbaubare RNA (P1).

P1-Struktur von SARS-COV-2

Viren dringen über spezifische Zelloberflächenrezeptoren in Zellen ein, verursachen eine Infektion und nutzen Wirtszellen zur Replikation.

Das Prinzip des viralen Nukleinsäurenachweises besteht darin, die virale RNA durch ein Zelllysat freizulegen und dann zum Nachweis die Echtzeit-Fluoreszenz-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zu verwenden.

Der Schlüssel zum Nachweisprinzip besteht darin, mithilfe von Primern und Sonden eine „gezielte Übereinstimmung“ von Nukleinsäuresequenzen zu erreichen, d.

Die Primer und Sonden sind gut auf die spezifische Region der SARS-CoV-2-Nukleinsäure abgestimmt, d. h. die Spezifität ist sehr hoch.Sobald das Ergebnis der Echtzeit-Fluoreszenz-RT-PCR-Amplifikation der zu testenden Probe positiv ist, beweist dies, dass SARS-CoV-2 in der Probe vorhanden ist.Siehe P2.

P2-Schritte der SARS-CoV-2-Nukleinsäurebestimmung (Echtzeit-Fluoreszenz-RT-PCR)

Bedingungen und Anforderungen des Labors für den Nachweis von SARS-CoV-2-Nukleinsäuren

Labore für Nukleinsäuretests eignen sich am besten für Umgebungen mit Unterdruck. Sie sollten auf die Drucküberwachung achten, die Luftzirkulation aufrechterhalten und Aerosole eliminieren.Das Personal für Nukleinsäuretests muss über entsprechende Qualifikationen verfügen, eine entsprechende Schulung zur Polymerase-Kettenreaktion absolvieren und die Bewertung bestehen.Das Labor muss strikt verwaltet und in Zonen unterteilt werden, und irrelevantem Personal ist der Zutritt strengstens untersagt.Der saubere Bereich sollte vor Ort belüftet und desinfiziert werden.Relevante Gegenstände werden in Zonen platziert, saubere und schmutzige Gegenstände werden getrennt, rechtzeitig ersetzt und vor Ort dekontaminiert.Routinemäßige Desinfektion: Für größere Flächen ist chlorhaltiges Desinfektionsmittel die Hauptlösung, für kleine Flächen kann 75-prozentiger Alkohol verwendet werden.Eine gute Möglichkeit, mit Aerosolen umzugehen, ist das Öffnen von Fenstern zum Lüften. Eine Luftdesinfektion kann auch durch ultraviolette Strahlen, Filterung und Luftdesinfektion erfolgen.

Wichtige Zusammenhänge und Parameter der SARS-CoV-2-Nukleinsäurebestimmung (Echtzeit-Fluoreszenz-RT-PCR)

Obwohl Labore im Allgemeinen große Aufmerksamkeit auf den „Nachweis“ von Nukleinsäuren legen, ist die „Extraktion“ von Nukleinsäuren tatsächlich auch einer der Schlüsselschritte für einen erfolgreichen Nachweis, der eng mit der Sammlung und Lagerung von Virusproben zusammenhängt.

Derzeit verwenden die am häufigsten verwendeten Atemwegsproben, wie z. B. Nasopharynxabstriche, die zweite Methode, bei der es sich um eine Inaktivierungslösung (Konservierung) handelt, die auf der Grundlage einer Nukleinsäureextraktion und einer Lyselösung hergestellt wird.Einerseits kann diese Viruskonservierungslösung das Protein des Virus denaturieren, seine Aktivität verlieren und nicht mehr infektiös sein und die Sicherheit der Transport- und Nachweisphase verbessern;Andererseits kann es das Virus direkt knacken, um die Nukleinsäure freizusetzen, das Nukleinsäure-zersetzende Enzym zu eliminieren und das Virus zu verhindern.Die RNA wird abgebaut.

Eine Virusprobenahmelösung, die auf Basis einer Nukleinsäureextraktions-Lyselösung hergestellt wird.Die Hauptbestandteile sind ausgewogene Salze, Ethylendiamintetraessigsäure-Chelatbildner, Guanidinsalz (Guanidinisothiocyanat, Guanidinhydrochlorid usw.), anionisches Tensid (Dodecan, Natriumsulfat), kationisches Tensid (Tetradecyltrimethylammoniumoxalat), Phenol, 8-Hydroxychinolin, Dithiothreitol, Proteinase K und mehrere oder mehrere andere Komponenten.Derzeit gibt es viele Arten von Nukleinsäure-Extraktionskits, und es werden verschiedene Nukleinsäure-Extraktions- und -Reinigungsreagenzien verwendet.Selbst wenn dasselbe Nukleinsäure-Extraktions- und -Reinigungsreagenz verwendet wird, sind die Extraktionsverfahren der einzelnen Kits unterschiedlich.

Derzeit werden die von der National Medical Products Administration zugelassenen Produkte für Nukleinsäure-Nachweiskits auf der Grundlage der ORF1ab-, E- und N-Gene im SARS-CoV-2-Genom ausgewählt.Die Nachweisprinzipien verschiedener Produkte sind grundsätzlich gleich, ihre Primer- und Sondendesigns sind jedoch unterschiedlich.Es gibt Einzelzielsegmente (ORF1ab), Doppelzielsegmente (ORF1ab, N oder E) und Dreizielsegmente (ORF1ab, N und E).Informationen zum Unterschied zwischen Nachweis und Interpretation, Nukleinsäureextraktion und Echtzeit-Fluoreszenz-RT-PCR-Reaktionssystem finden Sie in den entsprechenden Kit-Anweisungen. Es wird empfohlen, dass Benutzer die in den Kit-Anweisungen zur Interpretation angegebene Interpretationsmethode strikt befolgen.Die gemeinsamen Regionen, Primer und Sondensequenzen, die durch Echtzeit-Fluoreszenz-RT-PCR amplifiziert wurden, sind in P3 dargestellt.

P3 Die Position des SARS-CoV-2-Amplikonziels im Genom und die Sequenz von Primern und Sonden

Interpretation der Ergebnisse der SARS-CoV-2-Nukleinsäurebestimmung (Real-Time Fluoreszenz-RT-PCR)

„Pneumonia Prevention and Control Plan for SARS-CoV-2 Infection (Second Edition)“ klärte erstmals die Kriterien für die Beurteilung der Ergebnisse der Einzelgenamplifikation:

1. Kein Ct oder Ct≥40 ist negativ;

2. Ct<37 ist positiv;

3. Der Ct-Wert von 37-40 ist der Graustufenbereich.Es wird empfohlen, den Versuch zu wiederholen.Wenn das Ergebnis der Wiederholung von Ct<40 und die Amplifikationskurve deutliche Spitzen aufweist, wird die Probe als positiv beurteilt, andernfalls ist sie negativ.“

Die dritte Auflage des Leitfadens und die vierte Auflage des Leitfadens führten die oben genannten Kriterien fort.Aufgrund der unterschiedlichen Ziele, die in kommerziellen Kits verwendet werden, wurden in der oben genannten 3. Ausgabe des Leitfadens jedoch keine Kriterien für die Bestimmung der Kombination von Zielen angegeben, wobei betont wurde, dass die Anweisungen des Herstellers Vorrang haben.Ab der fünften Auflage der Leitlinien wurden zwei Ziele präzisiert, insbesondere die Beurteilungskriterien für ein einzelnes Ziel, das schwer zu beurteilen ist.Das heißt, wenn das Labor bestätigen möchte, dass ein Fall positiv für den SARS-CoV-2-Nukleinsäurenachweis ist, muss eine von zwei Bedingungen erfüllt sein:

(1) Zwei Ziele von SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) in derselben Probe werden durch Echtzeit-Fluoreszenz-RT-PCR positiv getestet.Wenn ein einzelnes Ziel positiv ist, sind eine erneute Probenahme und erneute Tests erforderlich.Wenn die Testergebnisse für das einzelne Ziel immer noch positiv sind, wird es als positiv beurteilt.

(2) Zwei Proben der Echtzeit-Fluoreszenz-RT-PCR zeigten gleichzeitig ein einzelnes Ziel positiv oder zwei Proben des gleichen Typs zeigten ein einzelnes Ziel positives Testergebnis, das als positiv beurteilt werden kann.Allerdings betonen die Leitlinien auch, dass negative Ergebnisse von Nukleinsäuretests eine SARS-CoV-2-Infektion nicht ausschließen können.Faktoren, die zu falsch negativen Ergebnissen führen können, müssen ausgeschlossen werden, darunter schlechte Probenqualität (Atemproben aus dem Oropharynx und anderen Teilen), zu frühe oder zu späte Probenentnahme, nicht ordnungsgemäße Lagerung, Transport und Verarbeitung der Proben sowie Probleme mit der Technologie selbst (Virusvariation, PCR-Hemmung) usw.

Ursachen für falsch negative Ergebnisse beim SARS-CoV-2-Nachweis

Der Begriff „falsch negativ“ bei Nukleinsäuretests, um den es derzeit geht, bezieht sich häufig auf „falsch negative Ergebnisse“, bei denen die Ergebnisse des Nukleinsäuretests nicht mit den klinischen Manifestationen übereinstimmen, d.Das Clinical Laboratory Center der National Health Commission erklärte den „falsch negativen“ SARS-CoV-2-Test.

(1) In den Zellen der infizierten Person befindet sich eine bestimmte Menge an Viren.Vorhandene Daten zeigen, dass das Virus nach einer Infektion des Körpers mit dem Virus über Nase und Mund in den Rachen, dann in die Luftröhre und die Bronchien gelangt und dann die Alveolen erreicht.Die infizierte Person erlebt die Inkubationszeit, leichte Symptome und dann den Prozess schwerer Symptome sowie verschiedene Stadien der Krankheit.Und die Menge des Virus, die in verschiedenen Teilen des Körpers vorhanden ist, ist unterschiedlich.

In Bezug auf die Viruslast der Zelltypen: Alveolarepithelzellen (untere Atemwege) > Atemwegsepithelzellen (obere Atemwege) > Fibroblasten, Endothelzellen und Makrophagen usw.;aus der Probenart: Alveolarspülflüssigkeit (am besten) > Sputum mit tiefem Husten > Nasopharyngealabstrich > Oropharyngealabstrich > Blut.Darüber hinaus kann das Virus auch im Kot nachgewiesen werden.In Anbetracht der Bequemlichkeit der Operation und der Akzeptanz der Patienten lautet die häufig verwendete klinische Probenreihenfolge jedoch oropharyngealer Abstrich > nasopharyngealer Abstrich > Bronchialspülflüssigkeit (komplexe Operation) und tiefer Auswurf (normalerweise trockener Husten, schwer zu erhalten).

Daher ist die Virusmenge in den Zellen des Oropharynx oder Nasopharynx einiger Patienten gering oder extrem niedrig.Werden zur Untersuchung ausschließlich Proben des Oropharynx oder Nasopharynx entnommen, wird die virale Nukleinsäure nicht nachgewiesen.

(2) Bei der Probenentnahme wurden keine virushaltigen Zellen gesammelt oder die virale Nukleinsäure wurde nicht wirksam konserviert.

[① Ungeeignete Sammelstelle, z. B. beim Sammeln von oropharyngealen Abstrichen, reicht die Sammeltiefe nicht aus, die gesammelten nasopharyngealen Abstriche werden nicht tief in der Nasenhöhle gesammelt usw. Bei den meisten gesammelten Zellen kann es sich um virusfreie Zellen handeln;

②Probenahmetupfer werden falsch verwendet.Für das Material des Tupferkopfes werden beispielsweise synthetische Fasern wie PE-Faser, Polyesterfaser und Polypropylenfaser empfohlen.Im tatsächlichen Betrieb werden Naturfasern wie Baumwolle (starke Proteinadsorption und nicht leicht auszuwaschen) und Nylonfasern (schlechte Wasseraufnahme, was zu einem unzureichenden Probenahmevolumen führt) verwendet.

③Unsachgemäße Verwendung von Virus-Aufbewahrungsröhrchen, wie z. B. der Missbrauch von Kunststoff-Aufbewahrungsröhrchen aus Polypropylen oder Polyethylen, die Nukleinsäuren (DNA/RNA) leicht absorbieren können, was zu einer Verringerung der Nukleinsäurekonzentration in der Aufbewahrungslösung führt.In der Praxis wird empfohlen, zur Aufbewahrung viraler Nukleinsäuren Polyethylen-Propylen-Polymer-Kunststoff und einige speziell behandelte Polypropylen-Kunststoffbehälter zu verwenden.]

[① Ungeeignete Sammelstelle, z. B. beim Sammeln von oropharyngealen Abstrichen, reicht die Sammeltiefe nicht aus, die gesammelten nasopharyngealen Abstriche werden nicht tief in der Nasenhöhle gesammelt usw. Bei den meisten gesammelten Zellen kann es sich um virusfreie Zellen handeln;

②Probenahmetupfer werden falsch verwendet.Für das Material des Tupferkopfes werden beispielsweise synthetische Fasern wie PE-Faser, Polyesterfaser und Polypropylenfaser empfohlen.Im tatsächlichen Betrieb werden Naturfasern wie Baumwolle (starke Proteinadsorption und nicht leicht auszuwaschen) und Nylonfasern (schlechte Wasseraufnahme, was zu einem unzureichenden Probenahmevolumen führt) verwendet.

③Unsachgemäße Verwendung von Virus-Aufbewahrungsröhrchen, wie z. B. der Missbrauch von Kunststoff-Aufbewahrungsröhrchen aus Polypropylen oder Polyethylen, die Nukleinsäuren (DNA/RNA) leicht absorbieren können, was zu einer Verringerung der Nukleinsäurekonzentration in der Aufbewahrungslösung führt.In der Praxis wird empfohlen, zur Aufbewahrung viraler Nukleinsäuren Polyethylen-Propylen-Polymer-Kunststoff und einige speziell behandelte Polypropylen-Kunststoffbehälter zu verwenden.]

(4) Der klinische Laborbetrieb ist nicht standardisiert.Probentransport- und Lagerbedingungen, standardisierter Betrieb klinischer Labore, Ergebnisinterpretation und Qualitätskontrolle sind die Schlüsselfaktoren zur Gewährleistung der Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Testergebnisse.Nach den Ergebnissen der externen Qualitätsbewertung, die vom Clinical Laboratory Center der National Health Commission vom 16. bis 24. März 2020 durchgeführt wurde, waren von den 844 Labors, die gültige Ergebnisse erhielten, 701 (83,1 %) qualifiziert und 143 (16,9 %) nicht.Qualifiziert, die Labortestbedingungen sind insgesamt gut, aber verschiedene Labore weisen immer noch Unterschiede in der Personalbedienungsfähigkeit, der Fähigkeit zur Interpretation positiver Einzelzielproben und der Qualitätskontrolle auf.

Wie kann das falsch negative Ergebnis des SARS-CoV-2-Nukleinsäurenachweises reduziert werden?

Die Reduzierung falsch negativer Ergebnisse beim Nukleinsäurenachweis sollte unter Berücksichtigung der vier Aspekte der Erzeugung falsch negativer Ergebnisse optimiert werden.

(1) In den Zellen der infizierten Person befindet sich eine bestimmte Menge an Viren.Die Konzentration des Virus in verschiedenen Körperteilen von mutmaßlich infizierten Personen wird zu unterschiedlichen Zeiten unterschiedlich sein.Wenn kein Rachen vorhanden ist, kann er sich in der Bronchialspülflüssigkeit oder im Kot befinden.Wenn mehrere Arten von Proben gleichzeitig oder in unterschiedlichen Stadien des Krankheitsverlaufs für Tests entnommen werden können, trägt dies dazu bei, falsch negative Ergebnisse zu vermeiden.

(2) Bei der Probenentnahme sollten virushaltige Zellen gesammelt werden.Dieses Problem kann weitgehend durch eine verstärkte Ausbildung der Probensammler gelöst werden.

(3) Zuverlässige IVD-Reagenzien.Durch die Durchführung von Untersuchungen zur Bewertung der Nachweisleistung von Reagenzien auf nationaler Ebene und die Erörterung der bestehenden Probleme kann die Nachweiseffizienz von Reagenzien weiter verbessert und die Empfindlichkeit der Analyse verbessert werden.

(4) Standardisierter Betrieb klinischer Labore.Durch die Stärkung der Schulung des Laborpersonals, die kontinuierliche Verbesserung des Laborqualitätsmanagementsystems, die Sicherstellung angemessener Aufteilungen und die Verbesserung der Erkennungsfähigkeit des Personals ist es möglich, falsch negative Ergebnisse aufgrund unsachgemäßer Laborabläufe zu reduzieren.

Gründe für den erneut positiven SARS-CoV-2-Nukleinsäuretest bei genesenen und entlassenen Patienten

Im „COVID-19-Diagnose- und Behandlungsplan (Trial Seventh Edition)“ ist eindeutig festgelegt, dass eines der Kriterien für die Heilung und Entlassung von COVID-19-Patienten aus dem Krankenhaus darin besteht, dass zwei aufeinanderfolgende Atemwegsproben einen negativen Nukleinsäuretest aufweisen (im Abstand von mindestens 24 Stunden), aber es gibt nur sehr wenige. Der SARS-CoV-2-Nukleinsäuretest war bei entlassenen Patienten aus verschiedenen Gründen erneut positiv.

(1)SARS-CoV-2 ist ein neues Virus.Es ist notwendig, den pathogenen Mechanismus, das Gesamtbild der verursachten Krankheit und die Merkmale des Krankheitsverlaufs besser zu verstehen.Daher ist es einerseits notwendig, das Management entlassener Patienten zu stärken und eine 14-tägige ärztliche Beobachtung durchzuführen.Führen Sie Nachsorge, Gesundheitsüberwachung und Gesundheitsberatung durch, um das Verständnis des gesamten Prozesses des Auftretens, der Entwicklung und des Verlaufs der Krankheit zu vertiefen.

(2) Der Patient kann erneut mit dem Virus infiziert werden.Der Akademiker Zhong Nanshan sagte: Da geheilte Patienten Antikörper haben, kann SARS-CoV-2 durch Antikörper eliminiert werden, wenn sie erneut eindringen.Es gibt viele Gründe, die die Ursache für die Genesung des Patienten sein können oder mit der Mutation des Virus oder sogar mit der Ursache von Labortests zusammenhängen können.Wenn es sich um das Virus selbst handelt, kann die SARS-CoV-2-Mutation dazu führen, dass der vom genesenen Patienten produzierte Antikörper gegen das mutierte Virus unwirksam ist.Sollte sich der Patient erneut mit dem mutierten Virus anstecken, kann der Nukleinsäuretest erneut positiv ausfallen.

(3)Was die Labortestmethoden betrifft, so hat jede Testmethode ihre Grenzen.Der Nachweis von SARS-CoV-2-Nukleinsäuren ist auf die Wahl der Gensequenz, die Zusammensetzung der Reagenzien, die Empfindlichkeit der Methode und andere Gründe zurückzuführen, was dazu führt, dass die vorhandenen Kits ihre eigenen niedrigeren Nachweisgrenzen haben.Nach der Behandlung des Patienten nimmt das Virus im Körper ab.Wenn die Viruslast in der zu untersuchenden Probe unter der unteren Nachweisgrenze liegt, wird ein „negatives“ Ergebnis angezeigt.Dieses Ergebnis bedeutet jedoch nicht, dass das Virus im Körper vollständig verschwunden ist.Das Virus kann nach Beendigung der Behandlung auftreten.Wiederaufleben“, weiter kopieren.Daher wird empfohlen, die Untersuchung einmal pro Woche innerhalb von 2 bis 4 Wochen nach der Entlassung durchzuführen.

(4) Nukleinsäure ist das genetische Material des Virus.Nach einer antiviralen Behandlung des Patienten wird das Virus abgetötet, die verbleibenden viralen RNA-Fragmente verbleiben jedoch weiterhin im menschlichen Körper und werden nicht vollständig aus dem Körper ausgeschieden.Manchmal kann es unter bestimmten Umständen besser erhalten bleiben.Eine lange Zeit, und zu diesem Zeitpunkt wird der Nukleinsäuretest „vorübergehend“ positiv ausfallen.Mit der Verlängerung der Genesungszeit des Patienten kann das Ergebnis des Nukleinsäuretests negativ ausfallen, nachdem die verbleibenden RNA-Fragmente im Körper allmählich erschöpft sind.

(5) Das Nukleinsäuretestergebnis von SARS-CoV-2 beweist nur das Vorhandensein oder Fehlen viraler RNA und kann nicht die Aktivität des Virus und die Übertragbarkeit des Virus beweisen.Es muss nachgewiesen werden, ob ein Patient, der erneut einen positiven Nukleinsäuretest aufweist, erneut zu einer Infektionsquelle wird.Es ist notwendig, eine Viruskultur an klinischen Proben durchzuführen und ein „lebendes“ Virus zu kultivieren, um nachzuweisen, dass es infektiös ist.

Zusammenfassung

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass falsch negative SARS-CoV-2-Nukleinsäuretests, erneut positive Ergebnisse und andere Zustände, die nicht mit den klinischen Manifestationen übereinstimmen, nicht vollständig vermieden werden können.Beim tatsächlichen Screening und Testen wird empfohlen, klinische Symptome, bildgebende Untersuchungen (CT) und Labortestergebnisse (Nukleinsäuretest + virusspezifischer Antikörpertest) für eine umfassende Diagnose zu kombinieren, um Fehldiagnosen und Fehldiagnosen zu vermeiden.Wenn sich herausstellt, dass die Testergebnisse offensichtlich nicht mit den klinischen Manifestationen übereinstimmen, wird empfohlen, eine umfassende Analyse der gesamten Testverbindung (Probenentnahme, Zirkulation und Verarbeitungsverbindungen) durchzuführen, um eine frühe Infektion mit dem SARS-CoV-2-Virus, eine wiederkehrende Infektion oder eine mögliche Kombination mit anderen Atemwegsvirusinfektionen usw. auszuschließen.Wenn die Bedingungen es zulassen, wird empfohlen, empfindlichere Proben wie Sputum oder Alveolarspülflüssigkeit für eine erneute Untersuchung zu entnehmen.

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