Autoren: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Abteilung: Jiaozhou-Krankenhaus, Dongfang-Krankenhaus, angegliedert an die Tongji-Universität

Der Hauptprobentyp für den Nukleinsäurenachweis von Atemwegspathogenen ist derzeit der Rachenabstrich.Es gibt viele Arten häufig verwendeter Probenkonservierungslösungen, die alle für den Transport und die Lagerung gekühlt oder eingefroren werden müssen.Es ist schwierig, den gesamten Prozess der niedrigen Temperatur während des Sammel- und Transportprozesses zu kontrollieren, und es ist schwierig, die Qualitätskontrolle vor der Probenprüfung sicherzustellen^[1-2].

RNase (RNase) ist eine Endonuklease, die RNA hydrolysiert und dabei hauptsächlich Phosphodiesterbindungen zwischen Nukleotiden trennt.Das RNase-Molekül ist sehr stabil, es gibt Disulfidbindungen in der Struktur und seine Aktivität erfordert nicht die Anwesenheit zweiwertiger Kationen, sodass RNase nicht leicht denaturiert wird und selbst nach hohen Temperaturen oder der Verwendung von Denaturierungsmitteln leicht zu renaturieren ist.RNasen werden in endogene und exogene RNasen unterteilt.Die körpereigenen RNasen können gleichzeitig mit dem Aufbrechen von Zellen freigesetzt werden.Daher ist die Eliminierung der Rolle endogener RNasen ein sehr wichtiger Schritt im RNA-Extraktionsprozess.Exogene RNasen sind weit verbreitet.RNasen kommen in der Luft, der menschlichen Haut, im Haar und im Speichel vor und sind wichtige Gründe für den leichten Abbau von RNA^[3].

Datenabfrage

CANS-CL02-A009 „Anwendung der Qualitäts- und Kompetenzakkreditierungsrichtlinien für medizinische Labore im Bereich der molekularen Diagnose“ schlägt in den technischen Anforderungen vor, dass geeignete Wasserqualitätsstandards entsprechend der Anwendung formuliert werden sollten;Luftdichte Einwegbehälter:

RNase/Klassifizierung

(1) RNase A

Ribonuklease A (RNase A) stammt aus der Bauchspeicheldrüse von Rindern und ist eine Endoribonuklease, die spezifisch das 3′-Ende von Pyrimidinresten auf der RNA angreifen kann, indem sie Cytosin oder Uracil schneidet, die von benachbarten Nukleotiden gebildet werden.Phosphodiesterbindung, das Endprodukt der Reaktion ist ein 3‘-Pyrimidinnukleotid und ein Oligonukleotid mit einem 3‘-Pyrimidinnukleotid am Ende.

(2) RNase T1

Ribonuklease T1 (RNase T1) stammt von Aspergillus orjzae, wirkt spezifisch auf das 3′-terminale Phosphat von Guanin und die Spaltungsstelle liegt zwischen dem 3′-Phosphat von Guanin und dem 5′-Hydroxyl benachbarter Nukleotide.Das Endprodukt der Reaktion sind 3′-Guanylsäure und Oligonukleotidfragmente mit 3′-Guanylsäure am Ende.

(3) RNase H

Ribonuklease H (RNase H) wurde erstmals aus Kalbsthymusgewebe entdeckt und ihr kodierendes Gen wurde in Escherichia coli kloniert.Es kann spezifisch DNA abbauen: RNA-Stränge in RNA-Hybrid-Duplexen, was zu Oligonukleotiden und Mononukleotiden mit 3′-OH- und 5′-Monophosphat-Enden führt; einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA kann es nicht abbauen.

RNase

Funktion und Verwendung

Ribonuklease kann den Abbau von Ribonukleinsäure (RNA) katalysieren und künstlich synthetisiert werden.Medizinische Salben werden äußerlich zur Behandlung von Traumata und Gelenkschmerzen eingesetzt.Berichten zufolge kann Ribonuklease den Stoffwechsel der Wirtszelle verändern, die Virussynthese hemmen, die Proliferation des Influenzavirus in vitro hemmen und die Bildung von Vaccinia- und Herpesviren in Hühnerembryonen hemmen.Klinische Anwendung der täglichen intramuskulären Injektion von 180 mg Ribonuklease, vorteilhaft für die Behandlung epidemischer Enzephalitis. Ribonuklease kann den Abbau von Ribonukleinsäure (RNA) katalysieren und kann nun künstlich synthetisiert werden.Medizinische Salben werden äußerlich zur Behandlung von Traumata und Gelenkschmerzen eingesetzt.Berichten zufolge kann Ribonuklease den Stoffwechsel der Wirtszelle verändern, die Virussynthese hemmen, die Proliferation des Influenzavirus in vitro hemmen und die Bildung von Vaccinia- und Herpesviren in Hühnerembryonen hemmen.Die klinische Anwendung einer täglichen intramuskulären Ribonuklease-Injektion von 180 mg ist vorteilhaft für die Behandlung epidemischer Enzephalitis.

RNase

Inhibitordefinition

Definition der RNase-Inhibitor-Einheit: Die Enzymmenge, die erforderlich ist, um 50 % der Aktivität von 5 ng RNase A zu hemmen, ist eine Einheit.

Wie RNase-Inhibitoren wirken

Guanidinisothiocyanat:

Guanidinisothiocyanat ist eine organische Verbindung mit der Summenformel C2H6N4S.Wird hauptsächlich in der biologischen Medizin, in chemischen Reagenzien usw. verwendet. Guanidinisothiocyanat ist ein Protein-Lysiermittel und wird häufig als Hauptbestandteil der Lyselösung in molekulardiagnostischen Reagenzien verwendet.Es kann Gewebe lysieren, die Zellstruktur zerstören und Nukleinsäure vom Nukleoprotein dissoziieren und weist eine starke Denaturierung zu RNase auf.Es ist derzeit der wirksamste RNase-Inhibitor.

TRIzol ist ein neuartiges Gesamt-RNA-Extraktionsreagenz, das Gesamt-RNA direkt aus Zellen oder Geweben extrahieren kann.Es enthält Substanzen wie Phenol und Guanidinisothiocyanat, die Zellen schnell zerstören und die von Zellen freigesetzten Nukleasen hemmen können.

(Das Guanidinisothiocyanat ist jedoch gefährlich für die Gesundheit von Laborforschern.)

RNasin:

Saures Glykoprotein, extrahiert aus Rattenleber oder menschlichem Blastoderm.Rnasin ist ein nichtkompetitiver Inhibitor von RNase, der an verschiedene RNasen binden und diese inaktivieren kann.

(Weitere Details:https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hhohe Temperatur:

Hohe Temperaturen sind ebenfalls ein häufiges Mittel zur Denaturierung von Proteinen.

Diethylpyrocarbonat (DEPC):

DEPC ist ein starker, aber unvollständiger RNase-Inhibitor, der die RNase-Aktivität hemmen kann, indem er sich mit dem Aminosäure-Imidazol-Ring der RNase-aktiven Gruppe verbindet, um Proteine ​​zu denaturieren.

Vanadyl-Ribonukleosid-Komplex:

Ein aus Vanadiumoxidionen und Nukleosiden gebildeter Komplex, der in Form von Übergangssubstanzen an RNase bindet und die Aktivität von RNase nahezu vollständig hemmen kann

andere:

Auch SDS, Harnstoff, Kieselgur usw. haben eine gewisse hemmende Wirkung auf die RNase.

Expertenbewertungen

Li Yujie Cheftechniker

Direktor der Laborabteilung des Jiaozhou-Krankenhauses, Dongfang-Krankenhaus der Tongji-Universität

Um den biologischen Abbau exogener RNase zu verhindern, sollten während des RNA-Extraktionsprozesses häufig Masken, Handschuhe und Mützen getragen und ausgetauscht werden.Alle Glaswaren müssen in einem Trockenofen bei 200 °C länger als 2 Stunden gebacken werden.Zum Backen verwendete Materialien wie Kunststoff müssen mit DEPC-Wasser behandelt und anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen werden.Die zur Extraktion, Konservierung und Identifizierung von RNA verwendeten Reagenzien oder Geräte sollten speziell für RNA bestimmt sein und ein unabhängiger RNA-Operationsbereich sollte eingerichtet werden.

Verweise:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Bakterien und Viren im Nasopharynx unmittelbar vor dem Ausbruch akuter Infektionen der unteren Atemwege bei indigenen australischen Kindern[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2018,37 (9): 1785-1794.

[2] Abteilung für Krankenhausinfektionskontrolle der Chinese Preventive Medicine Association.Richtlinien für die Sammlung und Untersuchung klinischer Mikrobenproben [J].Chinese Journal of Hospital Infection, 2018(20):3192-3200.

[3] „Klinischer Test Ten Thousand Why Molecular Biology Test Volume“