Ich glaube, dass jeder bei der Durchführung von PCR-Reaktionen immer auf diese oder jene Probleme stoßen wird, aber die meisten davon lassen sich in zwei Hauptprobleme einteilen:

Zu geringe Verstärkung der Genvorlage (Amplifikation);
Zu viel Nichtzielgenamplifikation.
Der Einsatz von Zusatzstoffen ist eine der gängigen Strategien zur Lösung dieser Probleme.Normalerweise besteht die Rolle von Zusatzstoffen aus zwei Aspekten:
Sekundärstrukturvon Genen (Sekundärstruktur);
Reduzieren Sie unspezifisches Priming.
Heute stellt Ihnen der Herausgeber kurz die gängigen Additive in PCR-Reaktionen und deren Funktionen vor.
Zusatzstoffe, die die Sekundärstruktur reduzieren
Sulfoxid(DMSO)
Genprobenmit hohem GC-Gehalt.DMSO reduziert jedoch auch die Aktivität der Taq-Polymerase erheblich.Daher muss jeder die Zugänglichkeit des Templates und die Aktivität der Polymerase in Einklang bringen.Der Herausgeber schlägt vor, dass Sie verschiedene DSMO-Konzentrationen ausprobieren können, beispielsweise 2 % bis 10 %, um die Konzentration zu finden, die zu Ihrem Experiment passt.
Nichtionische Reinigungsmittel
Nichtionische Reinigungsmittel wie 0,1–1 % Triton X-100, Tween 20 oder NP-40 reduzieren normalerweise die DNA-Sekundärstruktur.Obwohl dies die Amplifikation des Matrizengens erhöhen kann, führt es auch zu Problemen mit der unspezifischen Amplifikation.Daher eignen sich diese Zusätze gut für PCR-Reaktionen mit geringer Ausbeute ohne Ablagerungen, nicht jedoch so gut für relativ unreine PRC-Reaktionen.Ein weiterer Vorteil nichtionischer Reinigungsmittel ist die Reduzierung der SDS-Kontamination.Normalerweise wird während des DNA-Extraktionsprozesses SDS in den PCR-Schritt gebracht, was die Aktivität der Polymerase stark hemmt.Daher kann die Zugabe von 0,5 % Tween-20 oder Tween-40 zur Reaktion die negativen Auswirkungen von SDS neutralisieren.
Betain_
Betain kann die DNA-Amplifikation verbessern, indem es die Bildung von Sekundärstrukturen reduziert, und ist im Allgemeinen eine „mysteriöse“ Ergänzung zu kommerziellen PCR-Kits.Wenn Sie Betain verwenden möchten, sollten Sie Betain oder Betain-Monohydrat (Betain oder Betain-Monohydrat), jedoch kein Betain-Hydrochlorid (Betain-HCl) hinzufügen und eine Endkonzentration von 1-1,7 M einstellen.Betain kann auch zur Verbesserung der Spezifität beitragen, da es die Abhängigkeit von der Basenpaarzusammensetzung beim DNA-Schmelzen/DNA-Denaturierung beseitigt.
Zusätze zur Reduzierung unspezifischer Grundierung
Formamid
Formamid ist ein häufig verwendetes organisches PCR-Additiv.Es kann sich mit der großen und kleinen Furche in der DNA verbinden, wodurch die Stabilität der Master-DNA-Doppelhelix verringert und die Schmelztemperatur der DNA gesenkt wird.Die in PCR-Experimenten verwendete Formamidkonzentration beträgt normalerweise 1–5 %.
TetramethylAmmoniumchlorid( TMAC)
Tetramethylammoniumchlorid kann die Spezifität der Hybridisierung (Hybridisierungsspezifität) erhöhen und die Schmelztemperatur der DNA erhöhen.Somit kann TMAC unspezifisches Priming beseitigen und Fehlbindungen von DNA und RNA reduzieren.Wenn du benutztdegenerierte PrimerDenken Sie bei der PCR-Reaktion daran, TMAC hinzuzufügen, das üblicherweise in einer Konzentration von 15–100 mM verwendet wird.
Andere übliche Zusatzstoffe
Zusätzlich zu den beiden oben genannten Kategorien von Zusatzstoffen gibt es in PCR-Reaktionen viele gängige Zusatzstoffe, die zwar unterschiedliche Funktionen haben, aber auch sehr wichtig sind.
Magnesiumion
Magnesiumionen sind ein unverzichtbarer Cofaktor (Cofaktor) der Polymerase, d. h. ohne Magnesiumionen ist die Polymerase inaktiv.Zu viele Magnesiumionen können jedoch auch die Effizienz der Polymerase beeinträchtigen.Die Konzentration der Magnesiumionen in jeder PCR-Reaktion variiert.Chelatbildner (wie EDTA oder Citrat), die Konzentration von dNTPs und Proteinen beeinflussen alle die Konzentration von Magnesiumionen.Wenn Sie also Probleme mit Ihrem PCR-Experiment haben, können Sie versuchen, verschiedene Magnesiumionenkonzentrationen zu ändern, beispielsweise von 1,0 auf 4,0 mM, mit einem Abstand von 0,5–1 mM dazwischen.
Es ist zu beachten, dass mehrere Gefrier-Tau-Zyklen zu einer Konzentrationsschichtung der Magnesiumchloridlösung führen können.Deshalb müssen Sie es vor jedem Gebrauch vollständig auflösen und vor der Verwendung gut mischen.
Rinderserumalbumin(Rinderalbumin, BSA)
In molekularchemischen Experimenten ist Rinderserumalbumin ein sehr häufiger Zusatzstoff, insbesondere bei Restriktionsenzymverdauungen und PCR-Experimenten.Bei PCR-Reaktionen ist BSA hilfreich bei der Reduzierung von Verunreinigungen wie phenolischen Verbindungen.Und es heißt auch, dass es die Anhaftung von Reaktanten an der Wand des Reagenzglases verringern kann.Bei der PCR-Reaktion kann die Konzentration des zugesetzten BSA normalerweise 0,8 mg/ml erreichen.
 
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