Bei der direkten PCR handelt es sich um eine Reaktion, bei der tierisches oder pflanzliches Gewebe ohne Nukleinsäureextraktion direkt zur Amplifikation verwendet wird.In vielerlei Hinsicht funktioniert die direkte PCR wie eine normale PCR

Der Hauptunterschied besteht im verwendeten individuellen Puffer bei der direkten PCR. Die Probe kann ohne Nukleinsäureextraktion direkt der PCR-Reaktion unterzogen werden, es gelten jedoch entsprechende Anforderungen an die Verträglichkeit der Enzyme und die Kompatibilität des an der direkten PCR-Reaktion beteiligten Puffers.

Obwohl in gängigen Proben mehr oder weniger PCR-Inhibitoren enthalten sind, kann mit der direkten PCR unter Einwirkung von Enzymen und Puffern dennoch eine zuverlässige Amplifikation erzielt werden.Die herkömmliche PCR-Reaktion erfordert hochwertige Nukleinsäure als Matrize, die den reibungslosen Ablauf der PCR-Reaktion behindern kann, wenn die Matrize Proteine ​​und andere Verunreinigungen enthält.Die direkte PCR ist derzeit eine der beliebtesten Technologien im Bereich der molekularen Diagnostik.

01 Direkte PCR wurde ursprünglich für Tiere und Pflanzen verwendet

Die früheste Anwendung der direkten PCR liegt im Bereich von Tieren und Pflanzen, wie Blut, Gewebe und Haaren von Ratten, Katzen, Hühnern, Kaninchen, Schafen, Rindern usw., Pflanzenblättern und -samen usw., die zur Untersuchung von Genotypisierung, Transgenen, Plasmidnachweis, Gen-Knockout-Analyse, Identifizierung von DNA-Quellen, Artenidentifizierung, SNP-Analyse und anderen Bereichen verwendet werden.

Diese Felder haben einige gemeinsame Merkmale: Der Zielgengehalt ist relativ hoch und die Nukleinsäureextraktion ist mühsam. Daher kann die direkte PCR nicht nur Zeit sparen und einen geringen Einfluss auf die Ergebnisse haben, sondern auch Kosten sparen.

Die direkte PCR zum Nachweis von Krankheitserregern ist eine Sache der letzten Jahre, einige Hersteller von PCR-Reagenzien haben bei der Innovation große Anstrengungen in diese Richtung unternommen.Insbesondere in dieser COVID-19-Epidemie sind viele solcher Nachweisprodukte auf den Markt gekommen, wie beispielsweise das von Foregene erforschte und entwickelte SARS-CoV-2-Nukleinsäure-Nachweiskit (Multiplex-PCR-Fluoreszenzsondenmethode), das die Echtzeit-RT-PCR-Technologie (rRT-PCR) zum qualitativen Nachweis von SARS-CoV-2-Nukleinsäuren in menschlichen Nasopharyngeal- oder Oropharyngealabstrichproben verwendet.

Foregene ist eines der Unternehmen, die die Direct-PCR-Technologie zum Nachweis von normalem ORF1ab, N, E und verwendenVariante Abstammungslinien-Nukleinsäuren in menschlichen nasopharyngealen oder oropharyngealen Abstrichproben wie SARS-CoV-2 B.1.1.7-Abstammungslinie (UK), B.1.351-Abstammungslinie (ZA), B.1.617-Abstammungslinie (IND) und P.1-Abstammungslinie (BR).

02  Für die direkte PCR benötigte Reagenzien

Probenlysat

Das Probenlysat kann selbst konfiguriert oder gekauft werden.Der Unterschied in der Zusammensetzung verschiedener Lysatmarken führt zu unterschiedlichen Lysefähigkeiten und damit auch zu geringfügig unterschiedlichen Lysezeiten.Beispielsweise wird für die Vorbereitung tierischer Gewebeproben im Allgemeinen eine Lyse von 30 Minuten oder über Nacht empfohlen, und die Lyselösung für Viren reicht von 3 bis 10 Minuten.

PCR-Mastermix

Es wird empfohlen, Hot-Start-DNA-Polymerase zu verwenden, um die spezifische Amplifikation zu verbessern und die Amplifikationsfähigkeit zu erhöhen.Das Herzstück der direkten PCR ist eine hochtolerante Polymerase.

Eliminieren oder hemmen Sie Komponenten in der Probe, die die DNA-Amplifikation beeinflussen

Nachdem die Probe mit dem Lysat verarbeitet wurde, werden Proteine, Lipide und andere Zelltrümmer freigesetzt, diese Substanzen hemmen die PCR-Reaktion.Daher erfordert die direkte PCR die Zugabe entsprechender Entfernungs- oder Inhibitoren, um den Einfluss dieser Faktoren zu reduzieren.

03  Eine Sammlung von fünf Wissenspunkten zur direkten PCR

Erstens ist die Direct-PCR-Technologie eine direkte PCR-Technologie für verschiedene biologische Proben.Unter dieser technischen Voraussetzung besteht keine Notwendigkeit, die Nukleinsäure abzutrennen und zu extrahieren, die Gewebeprobe direkt als Objekt zu verwenden und die Zielgen-Primer hinzuzufügen, um die PCR-Reaktion durchzuführen.

Zweitens ist die Direct-PCR-Technologie nicht nur eine herkömmliche DNA-Template-Amplifikationstechnologie, sondern umfasst auch die Reverse-Transkription-PCR von RNA-Templates.

Drittens führt die Direct-PCR-Technologie nicht nur direkt routinemäßige qualitative PCR-Reaktionen an Gewebeproben durch, sondern umfasst auch Echtzeit-qPCR-Reaktionen, was erfordert, dass das Reaktionssystem über eine starke Anti-Hintergrund-Fluoreszenzinterferenzfähigkeit und endogene Fluoreszenzlöscher über die antagonistische Fähigkeit verfügt.

Viertens erfordern die Proben, auf die die Direct-PCR-Technologie abzielt, nur die Freisetzung von Nukleinsäure-Templates und entfernen keine Proteine, Polysaccharide, Salzionen usw., die die PCR-Reaktion stören.Dies erfordert, dass die Nukleinsäure-Polymerase und der PCR-Mix im Reaktionssystem eine hervorragende Widerstandsfähigkeit und Anpassungsfähigkeit aufweisen, um die Enzymaktivität und Replikationsgenauigkeit unter komplexen Bedingungen sicherzustellen.

Fünftens ist die Gewebeprobe, auf die die Direct-PCR-Technologie abzielt, ohne jegliche Nukleinsäureanreicherungsbehandlung und die Menge an Matrize ist sehr gering, was eine extrem hohe Empfindlichkeit und Amplifikationseffizienz des Reaktionssystems erfordert.