W:Bruder, die Reverse Transkription ist abgeschlossen und endlich der letzte Schritt – quantitative Fluoreszenz-PCR!Hey, Bruder, was ist quantitative Echtzeit-PCR?
M:PCR, das wissen Sie doch immer, oder?
W: Wissen Sie, PCR ist die Polymerase-Kettenreaktion und eine Technologie, die die DNA vermehrt!
M: Es ist fast... Es handelt sich um eine technische Methode, um die Zielsequenz durch spezifische Primer auf mehr als eine Million Mal zu amplifizieren. Dies zeigt jedoch nur das Vorhandensein oder Fehlen der Zielsequenz an und kann nicht die Menge der ursprünglichen Vorlage bestimmen.Die quantitative Fluoreszenz-PCR ist eine technische Methode, die zur Lösung dieses Problems entwickelt wurde.Als Begriffe werden im Allgemeinen Real-Time-PCR und Quantity-PCR (qPCR) bezeichnet.
W: Der Unterschied zur gewöhnlichen PCR liegt in der Fluoreszenzquantifizierung?
M: Ja, das heißt, in der Verlängerungsphase jedes PCR-Zyklus wird die Intensität des Fluoreszenzsignals erfasst und die anfängliche Template-Menge kann entsprechend der Änderung der Signalintensität berechnet werden.
W: Es fühlt sich so kompliziert an!Muss ich das selbst berechnen?
M: Dies erfordert, dass Sie langsam lernen. Am besten ist es, das Prinzip zu verstehen.Jetzt können Sie sich zunächst auf den CT-Wert konzentrieren, bei dem es sich um relativ intuitive experimentelle Daten handelt und dessen Größe der Größe der anfänglichen Vorlagenmenge entspricht.Es gibt auch Diagramme wie Verstärkungskurven und Schmelzkurven.Sie haben das letzte Wort darüber, ob Ihr Experiment erfolgreich ist oder nicht.
W:Oh, Bruder.Dann mache ich das qPCR-Experiment!
M: Achten Sie besonders darauf, keine Vorlagen zum Reagenzbereich hinzuzufügen, da Ihre ungenutzte Mischung sonst leicht kontaminiert wird!
W: Verstanden!

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