Real Time PCR, auch quantitative PCR oder qPCR genannt, ist eine Methode zur Echtzeitüberwachung und Analyse von PCR-Amplifikationsprodukten.
Da die quantitative PCR die Vorteile einer einfachen Bedienung, Schnelligkeit und Bequemlichkeit, hoher Empfindlichkeit, guter Wiederholbarkeit und geringer Kontaminationsrate bietet, wird sie häufig in medizinischen Tests, der Beurteilung der Arzneimittelwirksamkeit, der Genexpressionsforschung, der transgenen Forschung, dem Gennachweis, dem Nachweis von Krankheitserregern sowie dem Nachweis von Tieren und Pflanzen eingesetzt., Lebensmitteltests und andere Bereiche.
Unabhängig davon, ob Sie in der Grundlagenforschung in den Biowissenschaften tätig sind oder Mitarbeiter von Pharmaunternehmen, Tierhaltungsunternehmen, Lebensmittelunternehmen oder sogar Mitarbeiter von Ein-/Ausreisekontroll- und Quarantänebüros, Umweltüberwachungsabteilungen, Krankenhäusern und anderen Einheiten sind, sind Sie mehr oder weniger ausgesetzt Oder Sie müssen über Kenntnisse zur Beherrschung der quantitativen PCR verfügen.

Prinzip der Echtzeit-PCR

Bei der Echtzeit-PCR handelt es sich um eine Methode, bei der dem PCR-Reaktionssystem fluoreszierende Substanzen zugesetzt werden, die Intensität des Fluoreszenzsignals im Prozess der PCR-Reaktion in Echtzeit durch ein quantitatives PCR-Instrument überwacht und schließlich die experimentellen Daten analysiert und verarbeitet werden.

【Verstärkungskurve】ist die Kurve, die den dynamischen Prozess der PCR beschreibt.Die Amplifikationskurve der PCR ist eigentlich keine Standard-Exponentialkurve, sondern eine Sigmoidkurve.

[Plattformphase der Verstärkungskurve]Mit der Zunahme der Anzahl der PCR-Zyklen, der Inaktivierung der DNA-Polymerase, der Erschöpfung von dNTPs und Primern und der Hemmung der Synthesereaktion durch das Reaktionsnebenprodukt Pyrophosphat usw. dehnt sich die PCR nicht immer exponentiell aus.und wird schließlich ein Plateau erreichen.

[Exponentieller Wachstumsbereich der Amplifikationskurve]Obwohl die Plateauphase stark variiert, ist die Wiederholbarkeit in einem bestimmten Bereich des exponentiellen Wachstumsbereichs der Amplifikationskurve sehr gut, was für die quantitative Analyse der PCR sehr wichtig ist.

[Schwellenwert und Ct-Wert]Wir setzen den Grenzwert der Fluoreszenzdetektion an der entsprechenden Position im exponentiellen Wachstumsbereich der Amplifikationskurve, nämlich dem Schwellenwert (Threshold).Der Schnittpunkt des Schwellenwerts und der Verstärkungskurve ist der Ct-Wert, d. h. der Ct-Wert bezieht sich auf die Anzahl der Zyklen (Schwellenzyklus), wenn der Schwellenwert erreicht wird.

Die folgende Grafik zeigt deutlich die Beziehung zwischen Schwellenwertlinie und Verstärkungskurve, Schwellenwert und Ct-Wert.

【Wie quantifizieren?】

Durch die mathematische Theorie wurde bewiesen, dass der Ct-Wert eine umgekehrte lineare Beziehung zum Logarithmus der Anzahl der Anfangsvorlagen hat.Real Time PCR überwacht PCR-Amplifikationsprodukte in Echtzeit und quantifiziert sie während der exponentiellen Amplifikationsphase.

Mit jedem PCR-Zyklus erhöhte sich die DNA exponentiell um das Zweifache und erreichte bald ein Plateau.

Unter der Annahme, dass die Menge der Ausgangs-DNA A beträgt₀ Nach n Zyklen kann die theoretische Menge an DNA-Produkt wie folgt ausgedrückt werden:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Je höher dann die anfängliche DNA-Menge A 0 ist, desto eher erreicht die Menge des amplifizierten Produkts den Nachweiswert An, und die Anzahl der Zyklen bei Erreichen von An ist der Ct-Wert.Das heißt, je größer die anfängliche DNA-Menge A 0 ist, desto früher erreicht die Amplifikationskurve ihren Höhepunkt und desto kleiner ist entsprechend die erforderliche Anzahl an Zyklen n.

Wir führen eine Gradientenverdünnung des Standards bekannter Konzentration durch und verwenden ihn als Vorlage für die Echtzeit-PCR. Dabei wird in gleichen Abständen eine Reihe von Amplifikationskurven in der Reihenfolge der anfänglichen DNA-Menge von mehr zu weniger erhalten.Gemäß der linearen Beziehung zwischen dem Ct-Wert und dem Logarithmus der Anzahl der Startvorlagen a[Standardkurve] kann erstellt werden.

Durch Einsetzen des Ct-Werts der Probe mit unbekannter Konzentration in die Standardkurve kann die anfängliche Vorlagemenge der Probe mit unbekannter Konzentration ermittelt werden, was das quantitative Prinzip der Echtzeit-PCR darstellt.

Nachweismethode der Real Time PCR

Die Echtzeit-PCR erkennt PCR-Amplifikationsprodukte durch die Erkennung der Fluoreszenzintensität im Reaktionssystem.

Prinzip der Einbettungsmethode für fluoreszierende Farbstoffe】

Fluoreszierende Farbstoffe, wie TB Green ® , können in PCR-Systemen unspezifisch an doppelsträngige DNA binden und bei der Bindung fluoreszieren.

Die Fluoreszenzintensität im Reaktionssystem nahm mit der Zunahme der PCR-Zyklen exponentiell zu.Durch die Erfassung der Fluoreszenzintensität kann das Ausmaß der DNA-Amplifikation im Reaktionssystem in Echtzeit überwacht und anschließend die Menge der Ausgangsvorlage in der Probe umgekehrt abgeschätzt werden.

【Prinzip der Fluoreszenzsondenmethode】

Fluoreszenzsondeist eine Nukleinsäuresequenz mit einer fluoreszierenden Gruppe am 5‘-Ende und einer Löschgruppe am 3‘-Ende, die spezifisch an die Matrize binden kann.Wenn die Sonde intakt ist, wird die vom Fluorophor emittierte Fluoreszenz durch die Löschgruppe gelöscht und kann nicht fluoreszieren.Wenn die Sonde zersetzt wird, dissoziiert die fluoreszierende Substanz und emittiert Fluoreszenz.

Der PCR-Reaktionslösung wird eine fluoreszierende Sonde zugesetzt.Während des Tempervorgangs bindet die Fluoreszenzsonde an die spezifische Position der Vorlage.Während des Verlängerungsprozesses kann die 5′→3′-Exonukleaseaktivität des PCR-Enzyms die mit der Matrize hybridisierte fluoreszierende Sonde zersetzen, und die fluoreszierende Substanz wird dissoziiert, um Fluoreszenz zu emittieren.Durch die Erfassung der Fluoreszenzintensität der Sonde im Reaktionssystem kann der Zweck der Überwachung der Amplifikationsmenge des PCR-Produkts erreicht werden.

【Auswahl der Fluoreszenzdetektionsmethode】

Wenn es zur Unterscheidung von Sequenzen mit hoher Homologie und zur Durchführung eines Multiplex-PCR-Nachweises wie der SNP-Typisierungsanalyse verwendet wird, ist die Fluoreszenzsondenmethode unersetzlich.
Für andere Echtzeit-PCR-Experimente kann eine einfache, einfache und kostengünstige Fluoreszenz-Chimären-Methode verwendet werden.

SondenStarke Spezifität, fähig zur Multiplex-PCR

Mangel

Hohe Spezifitätsanforderungen an die Amplifikation;

Multiplex-PCR kann nicht durchgeführt werden. Es müssen spezielle Sonden entwickelt werden, hohe Kosten.

Manchmal ist das Sondendesign schwierig

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