Wie viel weißt du?

Über NExtraktion von Ukleinsäure

Der Anfang und das Ende der gereinigten Nukleinsäure

Am Anfang ist alles schwierig, gereinigte Nukleinsäure ist am schwierigsten

Initiierung molekularer Experimente für Folgeexperimente

Erfolg oder Misserfolg haben einen entscheidenden Einfluss.

Spuren-/Ultraspuren-UV-Spektrophotometer werden von vielen wissenschaftlichen Forschern bevorzugt, da sie Nukleinsäurekonzentrationen sowie Protein- und Salzionenrückstände einfach, schnell und wirtschaftlich erfassen können.

Wie wir alle wissen, bedeutet A260 den OD-Absorptionswert der Nukleinsäure, A280 den OD-Absorptionswert der Proteinkonzentration, A230 den OD-Absorptionswert der Salzionenkonzentration, sodass A260 die Nukleinsäurekonzentration umwandeln kann, A260/280 den Proteinrückstand und A260/230 den Salzionenrückstand, aber dies ist nur eine Regel, die von Forschern auf der Grundlage einer großen Anzahl von Messergebnissen entdeckt wurde, und es ist „konventionell” zu glauben, dass es die Reinheit von DNA und RNA erklären kannein gewisses Maß.Es handelt sich nicht um den einzigen Standard zur Bestimmung der Ausbeute und Reinheit von Nukleinsäuren, sondern dient nur als Referenz und ist kein „Goldstandard“.

Das Thermo Fisher ND-2000-Handbuch betont die Zuverlässigkeit der Testergebnisse

Der Grund dafür ist, dass die mit einem Mikro-/Ultramikro-UV-Spektrophotometer erzielten Ergebnisse nur die Ausbeute und Reinheit der Nukleinsäure von außen widerspiegeln und es viele Einflussfaktoren gibt (optischer Pfad, Probenvolumen, Probenkonzentration, pH-Wert, andere Ionen, die die Absorptionsmessung beeinflussen usw.), der gemessene OD-Wert ist nicht unbedingt genau.Gleichzeitig weisen einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA, RNA, dNTPs und einige Proteine ​​aufgrund der mangelnden Spezifität des Materials zur Bestimmung des Absorptionswerts Absorptionspeaks bei einer Wellenlänge von 260 nm auf, und die durch A260 allein bestimmte Konzentration entspricht nicht unbedingt der tatsächlichen DNA oder RNA.Die Konzentration sowie ihre Integrität und Verschlechterung können nicht beurteilt werden.

Wie lässt sich also die Qualität unserer gereinigten Nukleinsäure beurteilen?Neben der Verwendung eines Mikro-/Ultramikro-UV-Spektrophotometers zur Detektion sind auch Methoden wie die Agarosegelelektrophorese erforderlich, um die Reinheit und Integrität der Nukleinsäure visuell darzustellen und in gewissem Umfang die Konzentration anzuzeigen.Auf diese Weise sind die Ausbeute und Reinheit der Nukleinsäuren, die sich aus den Nachweisergebnissen verschiedener Methoden ergeben, glaubwürdig.

Experimenteller Diagrammvergleich

Genomische DNA von H1299-Zellen wurde mit den DNA-Extraktionskits von Unternehmen A extrahiert und es wurde eine erhebliche Verunreinigung mit Verunreinigungen festgestellt, die zu hohen OD-Werten führte

(OD-Messwert und entsprechendes Elektropherogramm)

Bewertungsindex

Gibt es einen „Goldstandard“ für die Prüfung der Nukleinsäureausbeute und -qualität?

Soweit wir wissen, gibt es keine einfache, schnelle und kostengünstige Methode.Ob Spektrophotometer, Gelelektrophorese oder Massenspektrometrie, sie alle spiegeln die Konzentration und Reinheit der Nukleinsäure in der Lösung unter verschiedenen Gesichtspunkten wider und müssen im Verhältnis zueinander beurteilt werden.

Der beste Bewertungsindex ist immerdie anschließende experimentelle Anwendung.Es hat keinen Einfluss auf die Effizienz der reversen Transkription und der PCR-Amplifikation.Eine erfolgreiche Nukleinsäureextraktion besteht darin, zuverlässige Amplifikationsprodukte und Ct-Werte zu erhalten und durch Sequenzierung eine vollständige Sequenz zu erhalten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ansicht der reinen Verhältnistheorie durch die Ansicht in Frage gestellt werden sollte, „gute nachgelagerte experimentelle Ergebnisse als gute Extraktionsparameter zu nutzen“!

Empfohlene DNA-RNA-Extraktionskits von Foregene für eine hohe DNA-/RNA-Reinheit:

https://www.foreivd.com/reagent/dna-isolation-series/

https://www.foreivd.com/reagent/rna-isolation-series/