PCR ist die am weitesten verbreitete Nukleinsäureamplifikationstechnologie und wird aufgrund ihrer Sensitivität und Spezifität häufig eingesetzt.Allerdings erfordert die PCR eine wiederholte thermische Denaturierung und kann die Einschränkungen durch den Einsatz von Instrumenten und Geräten nicht beseitigen, was ihre Anwendung in klinischen Feldtests einschränkt.

Seit den frühen 1990er Jahren haben viele Labore mit der Entwicklung einer Technologie zur Verstärkung bei konstanter Temperatur begonnen, die keine thermische Denaturierung erfordert.Jetzt haben sie die schleifenvermittelte isotherme Amplifikationstechnologie, die isotherme Strangersatz-Amplifikationstechnologie, die isotherme Rolling-Circle-Amplifikationstechnologie und die Nukleinsäuresequenzabhängigkeit entwickelt.Isotherme Verstärkungstechnologie und andere Technologien. 

Loop-vermittelte isotherme Verstärkung

Das Amplifikationsprinzip basiert auf der Tatsache, dass sich DNA bei etwa 65 °C in einem dynamischen Gleichgewichtszustand befindet.Wenn ein Primer ein Basenpaar bildet und auf den komplementären Teil der doppelsträngigen DNA ausgedehnt wird, dissoziiert der andere Strang und wird einzelsträngig.

Bei dieser Temperatur verwendet die DNA 4 spezifische Primer, die auf einer Strangverdrängungs-DNA-Polymerase basieren, um die Synthese der Strangverdrängungs-DNA kontinuierlich selbst zirkulieren zu lassen.

Bestimmen Sie zunächst die 6 spezifischen Regionen F3, F2, F1, B1, B2, B3 auf dem Zielgen und entwerfen Sie dann 4 Primer basierend auf diesen 6 spezifischen Regionen (wie in der folgenden Abbildung dargestellt):

Der Forward Inner Primer (FIP) besteht aus F1c und F2.

Der Backward Inner Primer (BIP) besteht aus B1c und B2 und TTTT wird als Spacer in der Mitte verwendet.

Die äußeren Primer F3 und B3 bestehen jeweils aus F3- und B3-Regionen auf dem Zielgen.

Im LAMP-Reaktionssystem ist die Konzentration des inneren Primers um ein Vielfaches höher als die des äußeren Primers.Der innere Primer wird zunächst mit dem Matrizenstrang kombiniert, um einen komplementären Strang zu synthetisieren und so einen DNA-Doppelstrang zu bilden.Anschließend wird der äußere Primer mit dem Matrizenstrang zu einem DNA-Doppelstrang kombiniert.Unter der Wirkung der BstDNA-Polymerase wird der vom inneren Primer synthetisierte Komplementärstrang freigesetzt.Nach einer Reihe von Reaktionen bildet der komplementäre Strang schließlich einen einzelnen DNA-Strang mit Hantelstruktur.

Der DNA-Einzelstrang mit Hantelstruktur selbst wird als Matrize verwendet, um kontinuierlich eine DNA mit Stamm-Schleifen-Übergangsstruktur und offenem Ende zu bilden.Die inneren und äußeren Primer führen dazu, dass die DNA mit der Übergangs-Stamm-Schleifen-Struktur kontinuierlich Strangverdrängungs- und Verlängerungsreaktionen durchläuft und schließlich mehrere Stamm-Schleifen-Strukturen mit unterschiedlichen Längen bildet.DNA-Mischung.

Vor- und Nachteile der schleifenvermittelten isothermen Verstärkung

Vorteile von LAMP:

(1) Hohe Amplifikationseffizienz, die 1–10 Kopien des Zielgens innerhalb von 1 Stunde effektiv amplifizieren kann, und die Amplifikationseffizienz beträgt das 10–100-fache der gewöhnlichen PCR.

(2) Die Reaktionszeit ist kurz, die Spezifität hoch und es ist keine spezielle Ausrüstung erforderlich.

Mängel von LAMP:

(1) Die Anforderungen an Grundierungen sind besonders hoch.

(2) Das amplifizierte Produkt kann nicht zum Klonen und Sequenzieren verwendet werden, sondern kann nur zur Beurteilung verwendet werden.

(3) Aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit kommt es leicht zur Bildung von Aerosolen, die zu falsch positiven Ergebnissen führen und die Testergebnisse beeinträchtigen.

SVerstärkung der Strangverschiebung

Strand Displacement Amplification (SDA) ist eine isotherme In-vitro-DNA-Amplifikationstechnik, die auf einer enzymatischen Reaktion basiert und erstmals 1992 vom amerikanischen Wissenschaftler Walker vorgeschlagen wurde.

Das Grundsystem von SDA umfasst eine Restriktionsendonuklease, eine DNA-Polymerase mit Strangverdrängungsaktivität, zwei Primerpaare, dNTPs sowie Calcium- und Magnesiumionen und Puffersysteme.

Das Prinzip der Strangverdrängungsamplifikation basiert auf der chemisch modifizierten Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenz an beiden Enden der Ziel-DNA.Die Endonuklease öffnet die Lücke im DNA-Strang an ihrer Erkennungsstelle, und die DNA-Polymerase erweitert die Lücke am 3′-Ende und ersetzt den nächsten DNA-Strang.

Die ersetzten DNA-Einzelstränge können mit Primern kombiniert und durch DNA-Polymerase zu Doppelsträngen verlängert werden.Dieser Vorgang wird kontinuierlich wiederholt, sodass die Zielsequenz effizient amplifiziert wird.

Vor- und Nachteile der Strangverdrängungsverstärkungstechnologie

Vorteile von SDA:

Die Amplifikationseffizienz ist hoch, die Reaktionszeit kurz, die Spezifität hoch und es ist keine spezielle Ausrüstung erforderlich.

Mängel von SDA:

Die Produkte sind nicht einheitlich, und im SDA-Zyklus werden immer einige einzelsträngige und doppelsträngige Produkte erzeugt, und beim Nachweis durch Elektrophorese kommt es zwangsläufig zu Tailing.

ROlling-Kreis-Verstärkung

Die Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) wird vorgeschlagen, indem sie auf der Methode des Kopierens von DNA aus pathogenen Organismen durch Rolling-Circle basiert.Es bezieht sich auf die Verwendung von einzelsträngiger zirkulärer DNA als Matrize bei konstanter Temperatur und einer speziellen DNA-Polymerase (wie Phi29) unter der Wirkung der Rolling-Circle-DNA-Synthese, um die Amplifikation des Zielgens zu erreichen.

RCA kann in lineare Verstärkung und exponentielle Verstärkung unterteilt werden.Der Wirkungsgrad von linearem RCA kann 10 erreichen⁵Mal, und die Effizienz von exponentiellem RCA kann 10 erreichen⁹mal.

Einfache Unterscheidung, wie in der folgenden Abbildung gezeigt: Die lineare Amplifikation a verwendet nur 1 Primer, die exponentielle Amplifikation b verfügt über 2 Primer.

Lineares RCA wird auch Single-Primer-RCA genannt.Ein Primer bindet an zirkuläre DNA und wird durch die Wirkung der DNA-Polymerase verlängert.Das Produkt ist ein linearer Einzelstrang mit einer großen Anzahl sich wiederholender Sequenzen, die tausendmal so lang sind wie eine einzelne Schleife.

Da das Produkt des linearen RCA immer mit dem Startprimer verbunden ist, ist die einfache Fixierung des Signals ein großer Vorteil.

Exponentielles RCA, auch bekannt als Hyper Branched Amplification HRCA (Hyper Branched RCA), bei exponentiellem RCA verstärkt ein Primer das RCA-Produkt, der zweite Primer hybridisiert mit dem RCA-Produkt und verlängert sich, und der Ersatz ist bereits an das RCA-Produkt gebunden. Die nachgeschalteten Primer verlängern den Strang und wiederholen Verlängerung und Ersatz, um ein dendritisches RCA-Amplifikationsprodukt zu erzeugen.

Die Vor- und Nachteile der Rolling-Circle-Nukleinsäureamplifikation

Vorteile von RCA:

Hohe Empfindlichkeit, gute Spezifität und einfache Bedienung.

Mängel von RCA:

Hintergrundprobleme bei der Signalerkennung.Während der RCA-Reaktion können die nicht zirkulierte Padlock-Sonde und die Template-DNA oder -RNA der ungebundenen Sonde einige Hintergrundsignale erzeugen. 

NNukleinsäuresequenzbasierte Amplifikation

Die Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA) ist eine neue Technologie, die auf der Basis der PCR entwickelt wurde.Es handelt sich um eine kontinuierliche und isotherme Nukleinsäureamplifikation, die durch ein Primerpaar mit einer T7-Promotorsequenz gesteuert wird.Die Technologie kann die Template-RNA in etwa 2 Stunden um etwa das 109-fache verstärken, was 1000-mal höher ist als bei der herkömmlichen PCR-Methode und keine spezielle Ausrüstung erfordert.

Diese Technologie wurde von Anfang an zur schnellen Diagnose von Krankheiten eingesetzt und viele Unternehmen verwenden diese Methode derzeit in RNA-Nachweiskits.

Obwohl die RNA-Amplifikation auch mithilfe der Reverse-Transkriptions-PCR-Technologie erfolgen kann, hat NASBA ihre eigenen Vorteile: Sie kann unter relativ konstanten Temperaturbedingungen durchgeführt werden und ist stabiler und genauer als die herkömmliche PCR-Technologie.

Die Reaktion findet bei 41 Grad Celsius statt und erfordert zur Vervollständigung AMV (Vogelmyeloblastosevirus) Reverse Transkriptase, RNase H, T7-RNA-Polymerase und ein Primerpaar.

Der Prozess umfasst im Wesentlichen:

Der Vorwärtsprimer enthält die komplementäre Sequenz des T7-Promotors.Während der Reaktion bindet der Vorwärtsprimer an den RNA-Strang und wird durch das AMV-Enzym katalysiert, um einen DNA-RNA-Doppelstrang zu bilden.

RNase H verdaut die RNA im hybriden Doppelstrang und behält die einzelsträngige DNA.

Unter der Wirkung des Reverse-Primers und des AMV-Enzyms entsteht ein DNA-Doppelstrang, der die T7-Promotorsequenz enthält.

Unter der Wirkung der T7-RNA-Polymerase wird der Transkriptionsprozess abgeschlossen und eine große Menge Ziel-RNA produziert.

Vorteile von NASBA:

(1) Sein Primer hat eine T7-Promotorsequenz, aber die fremde doppelsträngige DNA hat keine T7-Promotorsequenz und kann nicht amplifiziert werden, sodass diese Technologie eine hohe Spezifität und Empfindlichkeit aufweist.

(2) NASBA integriert den Reverse-Transkriptionsprozess direkt in die Amplifikationsreaktion und verkürzt so die Reaktionszeit.

Nachteile von NASBA:

(1) Die Reaktionskomponenten sind komplizierter.

(2) Um die Reaktionskosten zu erhöhen, sind drei Arten von Enzymen erforderlich.