PCR-Maschine|Verstehen Sie das wirklich?

Nobelpreisgekrönte PCR-Technologie

1993 erhielt der amerikanische Wissenschaftler Mulis den Nobelpreis für Chemie und seine Leistung war die Erfindung der PCR-Technologie.Der Zauber der PCR-Technologie liegt in den folgenden Eigenschaften: Erstens ist die Menge der zu amplifizierenden DNA extrem gering und theoretisch kann ein Molekül für die Amplifikation verwendet werden;Zweitens ist die Amplifikationseffizienz hoch und die Menge des Zielgens exponentiell.Verstärkung, mehr als 10 Millionen Mal in wenigen Stunden.Mittlerweile wird das PCR-Instrument in der biowissenschaftlichen Forschung und in vielen anderen Bereichen häufig eingesetzt.

Verschiedene Modelle und Hersteller von Thermocyclern können unterschiedliche Leistung und Wiederholbarkeit aufweisen.Diese Unterschiede wirken sich nicht nur auf die Effizienz der PCR aus, sondern auch auf die Genauigkeit und Konsistenz der erhaltenen Daten.Das Verständnis der Funktionen von PCR-Geräten kann uns dabei helfen, den Erfolg unserer Experimente zu maximieren.

Heizmodul

Die Genauigkeit der Temperatur des Thermocyclers kann entscheidend für den Erfolg oder Misserfolg der PCR sein.Auch die Temperaturkonstanz zwischen den einzelnen Vertiefungen am Heizblock ist entscheidend, um zuverlässige und reproduzierbare PCR-Ergebnisse zu erhalten.

Eine Möglichkeit, die thermische Genauigkeit sicherzustellen, besteht darin, häufig Tests mit Temperaturverifizierungskits durchzuführen und bei Bedarf von einem geschulten Fachmann neu zu kalibrieren.Temperaturverifizierungstests werden typischerweise verwendet, um:

Well-to-Well-Genauigkeit relativ zur eingestellten Temperatur im isothermen Modus

Well-to-Well-Genauigkeit relativ zur Solltemperatur nach Temperaturumrechnung

Genauigkeit der Temperatur des Heizdeckels

Temperaturkontrolle beim Primer-Glühen

Die Gradiententemperaturkontrolle ist eine Funktion des PCR-Instruments, die die Optimierung des Primer-Annealings in der PCR erleichtert.Der Zweck der Gradienteneinstellung besteht darin, unterschiedliche Temperaturen zwischen den Modulen zu erreichen, und bei einem Temperaturanstieg und -abfall von ≥2 °C zwischen den einzelnen Säulen können unterschiedliche Temperaturen gleichzeitig getestet werden, um die optimale Primer-Annealing-Temperatur zu erhalten.Theoretisch erreicht ein echter Gradient eine lineare Temperatur zwischen den Modulen.

Herkömmliche Gradienten-Thermocycler verwenden jedoch typischerweise einen einzigen Thermoblock und steuern die Temperatur über zwei Heiz- und Kühlelemente an beiden Enden, was häufig zu den folgenden Einschränkungen führt:

Es können nur zwei Temperaturen eingestellt werden: Die hohen und niedrigen Temperaturen für das Primer-Glühen werden an beiden Enden des Thermomoduls eingestellt, und eine genaue Einstellung anderer Temperaturen zwischen den Modulen ist nicht möglich

Aufgrund des Wärmeaustauschs zwischen den verschiedenen Säulen folgt die Temperatur zwischen verschiedenen Bereichen des Moduls eher einer sigmoidalen Kurve als einem echten linearen Gradienten.

Probentemperatur

Die Fähigkeit des Thermocyclers, die Probentemperatur zu kontrollieren, ist für die Genauigkeit der PCR-Ergebnisse sehr wichtig.Gerätespezifische Parameter wie Rampenraten, Haltezeiten und Algorithmen sind für die Vorhersage der Probentemperatur von entscheidender Bedeutung.

Die Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeit des PCR-Geräts bedeutet, dass sich die Temperatur zwischen PCR-Schritten ändert, die über einen bestimmten Zeitraum stattfinden.Da es eine gewisse Zeit dauert, bis die Wärme vom Modul auf die Probe übertragen wird, ist die tatsächliche Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeit der Probe langsamer.Daher muss die Definition der Temperaturänderungsgeschwindigkeit unterschieden und verstanden werden.

Die maximale oder Spitzenrampenrate des Moduls stellt die schnellste Temperaturänderung dar, die das Modul in einem sehr kurzen Zeitraum während der Rampe erreichen kann.

Die durchschnittliche Blockanstiegsrate stellt die Temperaturänderungsrate über einen längeren Zeitraum dar und bietet ein repräsentativeres Maß für die Geschwindigkeit der PCR-Maschine.

Die maximale Heiz- und Kühlrate der Probe und die durchschnittliche Heiz- und Kühlrate der Probe spiegeln die tatsächliche Temperatur der Probe wider.Die Rate der Probenerwärmung und -kühlung ermöglicht einen genaueren Vergleich der Leistung des PCR-Geräts und seiner möglichen Auswirkungen auf die PCR-Ergebnisse.

Bei der Durchführung eines Cycler-Austauschs wird empfohlen, ein Gerät mit einem Rampenratenprogramm zu verwenden, das den vorherigen Modus simuliert, um den Austausch zu erleichtern und die PCR-Wiederholbarkeit minimal zu beeinträchtigen.

Der Thermocycler sollte so konzipiert sein, dass die Zeitschritte erst dann gemessen werden, wenn die Probe die eingestellte Temperatur erreicht hat.Auf diese Weise wird die Zeit, die die Probe auf der eingestellten Temperatur gehalten wird, genauer mit den entsprechenden Zyklusbedingungen, die im Betriebsverfahren erforderlich sind, eingehalten.

Thermocycler nutzen oft komplexe mathematische Algorithmen, um sicherzustellen, dass Proben nach einem voreingestellten Programm schnell eine eingestellte Temperatur erreichen können.Basierend auf dem Volumen des Reaktionssystems und der Dicke der verwendeten PCR-Kunststoffe kann der Algorithmus die Temperatur der Probe und die Zeit vorhersagen, die benötigt wird, um die eingestellte Temperatur zu erreichen.Basierend auf diesen Algorithmen überschreitet die Blocktemperatur während des Heiz- oder Kühlvorgangs des Thermocyclers normalerweise den eingestellten Wert durch einen Prozess, der als Über- oder Unterschreitung des Thermoblocks bezeichnet wird.Ein solcher Aufbau stellt sicher, dass die Probe die eingestellte Temperatur so schnell wie möglich erreicht, ohne dass sie selbst über- oder unterschreitet.

Experimenteller Durchsatz

Zu den Faktoren, die den Durchsatz eines Thermocyclers steigern können, gehören Rampenraten, Thermoblockkonfigurationen und die Integration von Automatisierungsplattformen.

Die Aufheiz- und Abkühlrate des Thermocyclers stellt die Geschwindigkeit dar, mit der er die eingestellte Temperatur erreicht.Je schneller die Temperatur steigt und fällt, desto schneller läuft die PCR, was bedeutet, dass mehr Experimente in einem bestimmten Zeitraum durchgeführt werden können.Darüber hinaus können Experimente durch den Einsatz schnellerer DNA-Polymerasen beschleunigt werden.

Auch das Design des Thermocycler-Moduls ist für PCR-Experimente entscheidend.Austauschbare Module ermöglichen beispielsweise Flexibilität bei der Anzahl der Proben pro Lauf.Darüber hinaus eignen sich Heizmodule mit einzeln steuerbaren Modulen ideal, um verschiedene PCR-Programme gleichzeitig auf einem Thermocycler laufen zu lassen.

Für die automatisierte Hochdurchsatz-PCR sollte die Software, die das Pipettier-Handhabungssystem steuert, programmierbar und kompatibel sein.Automatisierte Systeme eignen sich ideal für die Durchführung von PCR-Reaktionen mit hohem Durchsatz, da sie mit geringem menschlichen Eingriff kontinuierlich durchgeführt werden können, wodurch die für den manuellen Versuchsaufbau erforderliche Zeit minimiert und die Anzahl der Reaktionen in einem bestimmten Zeitraum erhöht wird.

Zuverlässigkeit, Haltbarkeit und Qualitätssicherung von Thermocyclern

Zusätzlich zu den Leistungs- und Durchsatzfähigkeiten sollte das PCR-Gerät auch bestimmten wiederholten Verwendungen, Umweltbelastungen und Versandbedingungen standhalten können.Einige Hersteller berichten möglicherweise darüber, wie das Instrument Zuverlässigkeits- und Haltbarkeitstests durchführt.Der entsprechende PCR-Instrumentennachweis umfasst:

Zuverlässigkeit: Mit mechanischen Prüfständen werden wiederholte Tests an häufig verwendeten Instrumentenkomponenten wie Thermodeckeln, Bedienfeldern/Touchscreens und Temperaturwechselmodulen durchgeführt.

Umgebungsdruck: Mit Klimakammern können unterschiedliche Bedingungen von Routineexperimenten, wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit, simuliert werden.

Versandtests: Gemäß den Standards der International Safety Shipping Association können intensive Stoß- und Vibrationstests durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das Instrument in unbeschädigtem Betriebszustand ankommt.

Garantie und Service für die Wartung der PCR-Maschine

Trotz strenger Zuverlässigkeits- und Haltbarkeitstests kommt es bei Thermocyclern während der gesamten Lebensdauer des Geräts zwangsläufig zu technischen Problemen.Um beruhigt zu sein, sollten Sie beim Kauf eines Instruments die Garantie, den Service und die Wartung des Herstellers berücksichtigen.

Die Flexibilität von Dienstleistungen wie Vor-Ort-/Return-to-Factory-Wartung, Fernüberwachungsdienste und Ersatzinstrumente im Wartungsprozess usw., um die Auswirkungen auf die Arbeitseffizienz zu reduzieren.

Die Länge des Garantiezeitraums, die Bearbeitungszeit des Service, die Erreichbarkeit des technischen Supports und die Fähigkeiten des professionellen Supportpersonals.

Machbarkeit der Installation, des Betriebs, der Zusammenarbeit und der Überprüfung des Instruments, um die Laboranforderungen und damit verbundene behördliche Anforderungen zu erfüllen.Es stehen Wartungsdienste wie Temperaturüberprüfung, Tests und Kalibrierung zur Verfügung, um sicherzustellen, dass das Gerät mit den entsprechenden Parametern ordnungsgemäß funktioniert.

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