Als Neuling im Labor ist es keine gute Aufgabe, positive Pflanzen aus einer Reihe von Pflanzen mit einer niedrigen Umwandlungsrate herauszufiltern.Zunächst muss aus einer großen Anzahl von Proben einzeln DNA extrahiert werden, anschließend werden die fremden Gene per PCR nachgewiesen.Bei den Ergebnissen handelt es sich jedoch häufig um Leerzeichen und Streifen mit gelegentlich ein paar Elementen, es ist jedoch unmöglich festzustellen, ob es sich um Fehlerkennungen oder Fehlerkennungen handelt..Ist es sehr hilflos, solchen experimentellen Prozessen und Ergebnissen gegenüberzutreten?Machen Sie sich keine Sorgen, Bruder bringt Ihnen bei, wie Sie transgene positive Pflanzen einfach und genau aussortieren.

Schritt 1

Designerkennungsprimer

Bestimmen Sie das nachzuweisende endogene und exogene Gen entsprechend der zu testenden Probe und wählen Sie eine repräsentative 100-500-bp-Sequenz im Gen für das Primer-Design aus.Gute Primer können die Genauigkeit der Nachweisergebnisse sicherstellen und die Nachweiszeit verkürzen (siehe Anhang für häufig verwendete Nachweisprimer).

Hinweis: Die neu entwickelten Primer müssen die Reaktionsbedingungen optimieren und die Genauigkeit, Präzision und Nachweisgrenze des Nachweises vor dem groß angelegten Nachweis überprüfen.

Schritt 2

Entwerfen Sie ein experimentelles Protokoll

Positivkontrolle: Verwenden Sie die gereinigte DNA, die das Zielfragment enthält, als Vorlage, um zu bestimmen, ob das PCR-Reaktionssystem und die Bedingungen normal sind.

Negativ-/Leerkontrolle: Verwenden Sie die DNA-Vorlage oder ddH2O, die das Zielfragment nicht enthält, als Vorlage, um festzustellen, ob im PCR-System eine Kontaminationsquelle vorhanden ist.

Interne Referenzkontrolle: Verwenden Sie die Primer/Sonden-Kombination des endogenen Gens der zu testenden Probe, um zu bewerten, ob die Vorlage durch PCR nachgewiesen werden kann.

Notiz:

Für jeden Test sollten Positiv-, Negativ-/Blindkontrollen und interne Kontrollkontrollen festgelegt werden, um die Gültigkeit der Versuchsergebnisse zu bewerten.

Versuchsvorbereitung

Beobachten Sie vor der Anwendung, ob die Lösung gleichmäßig vermischt ist.Wenn Niederschlag festgestellt wird, muss dieser vor der Verwendung gemäß den Anweisungen aufgelöst und gemischt werden.Die 2×PCR-Mischung muss vor der Verwendung wiederholt mit einer Mikropipette pipettiert und gemischt werden, um eine ungleichmäßige Ionenverteilung zu vermeiden.

Notiz:

Nehmen Sie das Handbuch heraus, lesen Sie es sorgfältig durch und treffen Sie die Vorbereitungen vor dem Experiment in strikter Übereinstimmung mit den Anforderungen des Handbuchs.

Schritt 4

Bereiten Sie das PCR-Reaktionssystem vor

Mischen Sie gemäß dem Versuchsprotokoll die Primer, H2O und die 2×PCR-Mischung gleichmäßig, zentrifugieren Sie sie und verteilen Sie sie auf jedes Reaktionsgefäß.

Notiz:

Für groß angelegte Tests oder Langzeittests wird die Verwendung eines PCR-Reaktionssystems mit UNG-Enzym empfohlen, mit dem eine Aerosolkontamination durch PCR-Produkte wirksam vermieden werden kann.

Schritt 5

Reaktionsvorlage hinzufügen

Mit der Direct-PCR-Technologie ist kein langwieriger Nukleinsäure-Reinigungsprozess erforderlich, die Probenvorlage kann innerhalb von 10 Minuten vorbereitet und das entsprechende PCR-Reaktionssystem hinzugefügt werden.

Notiz:

Die Spaltungsmethode hat einen besseren Nachweiseffekt und das erhaltene Produkt kann für mehrere Nachweisreaktionen verwendet werden.

5.1: Direkte Ausbreitung der Blätter

Schneiden Sie entsprechend der Größe des Bildes im Handbuch das Blattgewebe mit einem Durchmesser von 2–3 mm ab und legen Sie es in das PCR-Reaktionssystem.

Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Blattfragmente vollständig in die PCR-Reaktionslösung eingetaucht sind, und fügen Sie nicht zu viel Blattgewebe hinzu.

5.2: Blattspaltmethode

Schneiden Sie das Blattgewebe mit einem Durchmesser von 5–7 mm ab und geben Sie es in ein Zentrifugenröhrchen.Wenn Sie reife Blätter wählen, vermeiden Sie bitte die Verwendung des Gewebes der Hauptader des Blattes.Pipettieren Sie 50 µl Puffer-P1-Lysat in ein Zentrifugenröhrchen, um sicherzustellen, dass das Lysat das Blattgewebe vollständig umhüllen kann, legen Sie es in einen Thermocycler oder ein Metallbad und lysieren Sie es 5–10 Minuten lang bei 95 °C.

50 µl Puffer P2-Neutralisierungslösung hinzufügen und gut vermischen.Das resultierende Lysat kann als Vorlage verwendet und dem PCR-Reaktionssystem hinzugefügt werden.

Hinweis: Die Menge der Vorlage beträgt zwischen 5 und 10 % des PCR-Systems und sollte 20 % nicht überschreiten (fügen Sie beispielsweise in einem 20-μl-PCR-System 1–2 μl Lyselösung hinzu, nicht mehr als 4 μl).

Schritt 6

PCR-Reaktion

Nach dem Zentrifugieren des PCR-Reaktionsgefäßes wird es zur Amplifikation in ein PCR-Gerät gegeben.

Notiz:

Die Reaktion verwendet eine nicht gereinigte Matrize zur Amplifikation, sodass die Anzahl der Amplifikationszyklen 5–10 Zyklen höher ist als bei Verwendung einer gereinigten DNA-Matrize.

Schritt 7

Elektrophorese-Erkennung und Ergebnisanalyse

M: 100 bp DNA-Leiter

1\4: Gereinigte DNA-Methode

2\5: Direkte PCR-Methode

3\6: Leerkontrolle

Qualitätskontrolle:

Die Testergebnisse der verschiedenen im Experiment festgelegten Kontrollen sollten die folgenden Bedingungen erfüllen.Andernfalls sollte die Ursache des Problems analysiert und der Test nach Beseitigung des Problems erneut durchgeführt werden.

Tabelle 1. Normale Testergebnisse verschiedener Kontrollgruppen

*Wenn das Plasmid als Positivkontrolle verwendet wird, kann das Ergebnis des endogenen Gentests negativ sein

Ergebnisurteil:

A. Das Testergebnis des endogenen Gens der Probe ist negativ, was darauf hinweist, dass die für den normalen PCR-Nachweis geeignete DNA nicht aus der Probe extrahiert werden kann oder die extrahierte DNA PCR-Reaktionsinhibitoren enthält und die DNA erneut extrahiert werden sollte.

B. Das Testergebnis des endogenen Gens der Probe ist positiv und das Testergebnis des exogenen Gens ist negativ, was darauf hinweist, dass aus der Probe DNA extrahiert wurde, die für den normalen PCR-Nachweis geeignet ist, und daraus geschlossen werden kann, dass das XXX-Gen in der Probe nicht nachgewiesen wurde.

C. Das Testergebnis des endogenen Gens der Probe ist positiv, und das Testergebnis des exogenen Gens ist positiv, was darauf hinweist, dass DNA, die für den gewöhnlichen PCR-Nachweis geeignet ist, aus der Probe extrahiert wurde und die Proben-DNA das XXX-Gen enthält.Es können weiterhin Bestätigungsexperimente durchgeführt werden.

Schritt 8

Designerkennungsprimer

Wischen Sie nach dem Experiment den Versuchsbereich mit 2 %iger Natriumhypochloritlösung und 70 %iger Ethanollösung ab, um Umweltverschmutzung zu vermeiden.