Tipps zur Verbesserung der Leimrückgewinnung

1. Erhöhen Sie die Probenmenge während der Elektrophorese.

2. Verwenden Sie frisch zubereiteten Elektrophoresepuffer.

3. Versuchen Sie beim Schneiden von Leim, nur den Leim in Streifen zu schneiden, um das Volumen des Leimschnitts zu verringern: Sie benötigen keinen Leim mit wenigen Zweckfragmenten, da dies sonst die Rückgewinnungsrate beeinträchtigt.

4. Nachdem Sie zwei oder mehr Leimstücke geschmolzen haben, verwenden Sie ein Röhrchen, egal wie groß das Volumen ist, und übertragen Sie es in dieselbe Säule.

5. Die dem Sol zugesetzte Lösung kann etwas mehr sein, was die Bindung der DNA an die Membran begünstigt, im Allgemeinen jedoch 750 ul nicht überschreitet.

6. Der Schlüssel zur Gelrückgewinnung liegt darin, DNA über die Salzkonzentration, den Säuregehalt (Ladung) und die Hydrophobizität der Lösung in der Säule an die Säule zu binden.Wenn der pH-Wert des Elektrophoresepuffers zu hoch ist, können daher 10 µl (pH 5,0, 3 mol/L NaAC) zum Sol gegeben werden;Um DNA-Moleküle auf der Membran besser abzufangen, kann nach dem Auflösen des Klebers 30 % Isopropanol zum Erhitzen in die Flüssigkeit gegeben werden.

7. Lassen Sie die Säule vor der Zugabe des Eluenten einige Minuten (ca. 10 Minuten) bei Raumtemperatur stehen, um das Ethanol vollständig zu verdampfen.

8. Zum Schluss fügen Sie weniger Eluent hinzu, um das Rückgewinnungsvolumen zu minimieren.Im Allgemeinen werden 30–50 μl Eluent zur Elution verwendet (nicht zu wenig, da es sonst die Membran nicht benetzen kann, was der Elution nicht förderlich ist);Die Elutionströpfchen befinden sich in der Mitte der Membran, um die an die Membran gebundene DNA vollständig zu eluieren.

9. Nach Zugabe des Elutionsmittels kann es 5 Minuten lang in einem Wasserbad von 55 Grad eluiert oder länger als 10 Minuten in ein Wasserbad von 50 Grad gestellt oder über Nacht mit einem Parafilm bei 4 Grad versiegelt und dann zur Wiederherstellung am nächsten Tag zentrifugiert werden. Die Wirkung ist gut.

10. Das zentrifugierte Eluat zurück in die Adsorptionssäule geben und erneut zentrifugieren.

Detaillierte Methoden und Verfahren zur PCR-Produktrückgewinnung

1. Gewöhnliches Gummirecycling

Wenn Sie den Kleber zurückgewinnen möchten, verwenden Sie am besten ein Kit, das praktisch ist und eine etwas höhere Rückgewinnungsrate aufweist.Wenn Sie es wirklich manuell wiederherstellen müssen, können Sie nach dem Schneiden des Klebers das Dreifache des TE-Volumens hinzufügen.Nach dem Schmelzen im Wasserbad werden Phenol, Phenol/Chloroform sauber extrahiert und Ethanol ausgefällt.Das ist es.

2. DNA-Gewinnung aus Gelen mit niedrigem Schmelzpunkt

Reinigung von DNA-Fragmenten Geben Sie TE (10 mmol/l Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mmol/l EDTA) entsprechend dem Volumen des Gels hinzu und legen Sie es 5 Minuten lang in ein 65 °C warmes Wasserbad, um das Gel vollständig aufzulösen.

Nachdem es auf Raumtemperatur gebracht worden war, wurde eine gleiche Menge Phenol (gesättigt mit TE, TE wurde in der oberen Schicht eingeschlossen und die untere Phenolschicht wurde entfernt) zugegeben und die Mischung vorsichtig gemischt (kein Mischen erforderlich) und 3 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert.1-2 Mal wiederholen.

Nehmen Sie den Überstand, geben Sie 0,1 Volumen 3 mol/L Natriumacetat (pH 5,2) und das 2,5-fache Volumen absoluten Ethanols hinzu, um die Ethanolfällung durchzuführen.Lösen Sie die gereinigte DNA mit einer geeigneten Menge TE auf, messen Sie den Inhalt und bereiten Sie sie für die Verwendung vor (sie kann für die Analyse der Zielgenstruktur, die Sondenvorbereitung usw. verwendet werden).

3. PCR-Wiederherstellung mit guter Amplifikationsspezifität

Wenn die Spezifität der PCR-Amplifikation gut ist, genügt eine einfache Reinigung und Gewinnung des PCR-Produkts.Sie können dem PCR-Produkt 50 µg/ml Proteinase K bei 37 Grad für 1 Stunde hinzufügen, einmal mit Phenol/Chloroform extrahieren, einmal mit Chloroform extrahieren und 0,1 Volumen des Überstands hinzufügen.Das Natriumacetat wurde durch Fällung mit 2,5 Volumina absolutem Ethanol gewonnen.

Verwandte Produkte:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/