Herkömmliche Reverse Transkriptasen vertragen keine hohen Temperaturen (die optimale Temperatur für die MMLV-Aktivität liegt bei 37–50 °C und bei AMV bei 42–60 °C).Die komplexere virale RNA kann bei niedrigen Temperaturen nicht effektiv revers in cDNA transkribiert werden, was zu einer Verringerung der Nachweiseffizienz führt.Herkömmliche RT-qPCR erfordert im Allgemeinen die Beteiligung von zwei Schlüsselenzymen (reverse Transkriptase und DNA-Polymerase), was es unmöglich macht, den Betrieb des Reaktionssystems zu vereinfachen und die Kosten zu senken.Hier stellen wir zwei hochtemperaturbeständige Reverse Transkriptasen vor, TtH und RevTaq.Diese beiden Enzyme haben auch die Funktion der DNA-Polymerase und werden daher als bifunktionale Enzyme bezeichnet.

TtH-DNA-Polymerase

Sie haben sicher schon von TtH gehört, das aus dem thermophilen Bakterium Thermus thermophilus HB8 stammt.In Gegenwart zweiwertiger Kationen wie Mg2+ weist es DNA-Polymeraseaktivität auf.Es wird häufig in PCR-Reaktionen wie das Taq-Enzym verwendet, weist jedoch eine höhere Hitzebeständigkeit als das Taq-Enzym auf und hat daher auch eine bessere Wirkung auf die PCR mit Vorlagen mit hohem GC-Gehalt.

· Dieses Enzym hat grundsätzlich keine 3′→5′-Exonukleaseaktivität und 5′→3′-Exonukleaseaktivität und kann daher auch für die Didesoxysequenzierung verwendet werden.

· Dieses Enzym hat RTase-Aktivität.In Gegenwart von Mn2+ wird die RTase-Aktivität erhöht.Mit dieser Funktion können Reverse-Transkriptionsreaktionen und PCR-Reaktionen im selben Röhrchen durchgeführt werden, d. h. eine einstufige RT-PCR.Allerdings ist die Genauigkeit der RT-PCR in Gegenwart von Mn2+ nicht hoch.Die RT-Aktivität hat nichts mit der RNAase-H-Aktivität zu tun.

· Die erhöhte Aktivität der Tth-DNA-Polymerase (pH9, optimal +55℃~+70℃, maximal +95℃) überwindet die durch die RNA-Sekundärstruktur verursachten Probleme.Die resultierende cDNA kann durch PCR mit demselben Enzym in Gegenwart von Mg2+-Ionen amplifiziert werden.

· Die Fähigkeit der Tth-DNA-Polymerase, bei hohen Temperaturen eine reverse Transkription und DNA-Amplifikation durchzuführen, macht dieses Enzym nützlich für quantitative RT-PCR, Klonierung und Genexpressionsanalyse von zellulärer und viraler RNA.
· Tth-DNA-Polymerase wird für RT-PCR verwendet, um RNA bis zu 1 kb zu amplifizieren.

Merkmale und Vorteile

Tth-DNA-Polymerase:

• Stellen Sie sicher, dass die Produktgröße der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) optimiert ist, mindestens 1000 bp in der RT-PCR-Reaktion

• Akzeptieren Sie modifiziertes Desoxyribonukleosidtriphosphat als Substrat

• Steht in keinem Zusammenhang mit der RNase-H-Aktivität

• Verfügt über eine hohe thermische Stabilität zur Überwindung von Problemen, die normalerweise mit der hohen Sekundärstruktur der RNA zusammenhängen

RevTaq RT-PCR DNA-Polymerase

Eine hitzebeständige DNA-Polymerase mit Reverse-Transkriptase-Aktivität

RevTaq-RT-PCR-DNA-Polymerase ist ein konstruiertes, äußerst hitzebeständiges, dualfunktionales Enzym mit Reverse-Transkriptase- und DNA-Polymerase-Aktivitäten, das durch gezielte und künstliche Evolution gewonnen wird.

· Die Halbwertszeit der RevTaq RT-PCR DNA-Polymerase bei 95 °C beträgt mehr als 40 Minuten.

· Die RevTaq RT-PCR-DNA-Polymerase ermöglicht eine Hochtemperatur-Reverse-Transkription direkt von der RNA-Vorlage, und der Reverse-Transkriptionsschritt kann mehrmals wiederholt werden, um mehr cDNA-Vorlagen zu erzeugen.

· Die RevTaq RT-PCR-DNA-Polymerase ermöglicht eine „Nullschritt“-RT-PCR (kein isothermer Reverse-Transkriptionsschritt), da im zyklischen PCR-Verlängerungsschritt Reverse Transkription und DNA-Amplifikation gleichzeitig erfolgen.Dadurch wird auch die Reverse-Transkriptionsreaktion bei hohen Temperaturen gefördert, wodurch die Probleme minimiert werden, die beim Schmelzen der starken Sekundärstruktur in RNA bei hohen Temperaturen auftreten.

· Aufgrund der Aptamer-basierten Hot-Start-Formel liefert die RevTaq RT-PCR DNA-Polymerase bessere Ergebnisse, wenn die Annealing- und Extension-Temperatur höher als 57 °C ist.

· Da das Enzym hitzebeständig ist, wird empfohlen, Primer und Sonden mit sehr hohen Schmelzpunkten (>60 °C) zu entwerfen.

· Es wird empfohlen, die Temperatur des Glüh-/Verlängerungsschritts durch einen Temperaturgradienten während des Reaktionsaufbauprozesses zu optimieren.

· Je höher die Temperatur, desto höher ist die Spezifität der PCR.Der Reverse-Transkriptionszyklus wird normalerweise bei einer höheren Temperatur als der PCR-Zyklus durchgeführt, da die DNA-Primer:RNA-Template-Hybridisierung normalerweise einen höheren Schmelzpunkt aufweist als der DNA-Primer:cDNA-Template-Duplex.

· Die RevTaq RT-PCR-DNA-Polymerase ist gentechnisch verändert und optimiert und die Amplikongröße liegt zwischen 60 und 300 bp.

Die Nachweisgrenze der RevTaq RT-PCR-DNA-Polymerase erreicht 4 Kopien/

Das optimierte Reaktionssystem (die Etablierung von Primern mit hohem Schmelzpunkt) ist in der Abbildung dargestellt.RevTaq RT-PCR DNA-Polymerase-gesteuerte RT-PCR zeigt eine bessere Empfindlichkeit als der TaqPath 1-Schritt-RT-qPCR-Mastermix und einen geringeren Probenverdünnungsgradienten für die Detektion.

Weitere Vorteile:

Schnellstartfunktion → Der anfängliche thermische Denaturierungsschritt kann übersprungen werden.

Hot-Start-Aptamer-Formel → Bietet sofort 100 % Enzymaktivität und verhindert unspezifische Amplifikation bei niedrigen Temperaturen (<57 °C).

Spaltungsfunktion → Der RNA-Extraktionsschritt entfällt, da die RevTaq RT-PCR DNA-Polymerase auch rohe Reaktionsproben verarbeiten kann.Es kann in einem heißen RT-PCR-Zyklus die Zellmembranen von Eukaryoten, Bakterien und Viren sofort zerstören.

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