RNase ist ein heikles Wort, das viele Studenten, die häufig RNA-Extraktionsexperimente durchführen, nicht hören wollen.Voll bewaffnet wurde die schließlich mit den hochgiftigen Reagenzien Phenol und Chloroform extrahierte RNA abgebaut.Ich bin nicht versöhnt!!!Werfen wir heute einen Blick auf den Ursprung des berühmten Rnase.

Ribonuklease (RNase) oder RNase ist eine Nuklease, die RNA in kleine Moleküle hydrolysieren kann.RNase ist als niedermolekulares Protein ungewöhnlich stabil .Herkömmliche Hochtemperatur- und Hochdruck-Dampfsterilisation sowie Proteininhibitoren können es nicht vollständig inaktivieren.Die Stabilität von RNase beruht hauptsächlich auf den Disulfidbindungen in der Struktur.Beispielsweise hat die häufig verwendete RNase der Rinderpankreas nur 124 Aminosäuren, enthält aber 4 Disulfidbindungen.Schwefelbindung und Disulfidbindung verleihen RNase eine hervorragende thermische Stabilität.Darüber hinaus hat RNase ein relativ geringes Molekulargewicht und kann in vielen Fällen schnell ihre ursprüngliche Konformation wiederherstellen.

Abgesehen davon, dass es äußerst stabil ist,RNasen sind im Labor allgegenwärtig .RNase ist ein biologischer Abwehrmechanismus.Für eine Zelle ist exogene RNA oft tödlich.Im Vergleich zu exogener DNA ist exogene RNA oft gefährlicher.RNA wird problemlos transkribiert und übersetzt, daher haben fast alle Organismen RNasen entwickelt, um sich gegen die Invasion exogener RNA zu verteidigen.Daher verströmen die im Labor gezüchteten Bakterienzellen und Sie, die RNA extrahieren, den Duft von RNase.Menschliche Körperflüssigkeiten (Speichel, Tränen usw.) enthalten große Mengen an RNase. Weinen Sie also nicht, wenn die RNA abgebaut wird.Je mehr Sie weinen, desto schlimmer ist der RNA-Abbau!!Schwester Daiyu ist nicht für die RNA-Extraktion geeignet!

Darüber hinaus enthält Ihre empfindliche Haut auch viel RNase und auch die Marker, Pipetten, Kühlschranktüren und Türgriffe, die mit der Haut in Berührung gekommen sind, enthalten RNase.

Lassen Sie uns nach so viel Geschwafel einen Blick darauf werfen, wie man mit RNasen umgeht.

Das Erste, woran jeder bei der Entfernung von RNA denkt, istDEPC(Diethylpyrocarbonat).DEPC denaturiert das Protein hauptsächlich, indem es sich mit dem Imidazolring der RNase-aktiven Gruppe Histidin verbindet und dadurch die Aktivität des Enzyms hemmt.0,1 % DEPC können eine bessere Entfernungswirkung auf Rnase haben, wir müssen jedoch bedenken, dass DEPC bekanntermaßen krebserregend ist, weshalb bei der Verwendung besondere Vorsicht geboten ist.

Für RNase müssen wir von zwei Aspekten ausgehen:Die erste besteht darin, die Aktivität der endogenen RNase zu hemmen

Herkömmliche RNA-Extraktionsreagenzien wie Guanidinisothiocyanat und DTT, die in Trizol enthalten sind, können die Disulfidbindung von RNase öffnen, es gibt jedoch immer noch einige RNasen, insbesondere in Gewebeproben. Achten Sie daher auf niedrige Temperaturen.

1.Tauchen Sie die Gewebeprobe sofort nach der Entnahme in flüssigen Stickstoff oder in eine handelsübliche RNA-Konservierungslösung.

2.Nachdem Sie die RNA der Zellprobe extrahiert haben, fügen Sie sie der Lyselösung hinzu und lysieren Sie sie auf der Eisbox

3. Zum Mahlen verwenden Sie am besten flüssigen Stickstoff wenn Gewebeproben homogenisiert werden.Bei der Verwendung eines elektrischen Homogenisators ohne flüssigen Stickstoff ist auf eine vollständige Vorkühlung des Homogenatadapters zu achten.

Die zweite ist exogene DNase

1.Seien Sie voll bewaffnet, tragen Sie einen Laborkittel, tragen Sie eine Maske und tragen Sie unbedingt ein Paar neue Handschuhe (seien Sie nicht so sparsam!! Es ist zu beachten, dass Trizol sehr ätzend ist und auch durch Handschuhe hindurch sehr stark ist, also nicht auf Ihre Hände tropfen).

2.Alle gebrauchten Pipettenspitzen, EP-Röhrchen, PCR-Röhrchen und andere Geräte müssen de-RNase-behandelt werden.Es kann in 0,1 % DEPC eingeweicht und dann unter hohem Druck gesetzt werden.Achten Sie auf den Betrieb in einem Abzug.Lokale Tyrannen können Verbrauchsmaterialien zur Entfernung von Enzymen direkt kaufen.

PS: Lassen Sie mich Ihnen eine faule Methode nennen.Obwohl hohe Temperaturen und hoher Druck RNase nicht vollständig entfernen können, wird ein großer Teil davon entfernt.2-fache hohe Temperatur und hoher Druck haben eine gute Wirkung, und die Extraktion von RNA hat nur eine geringe Wirkung.

3.Alkohol kann Proteine ​​denaturieren,Daher kann der RNA-Extraktionstisch mit 75 %igem Alkohol abgewischt werden , und Handschuhe können auch mit Alkohol besprüht werden.

4.Die endgültige RNA-Auflösungslösung und das Zentrifugenröhrchen sollten ebenfalls mit De-RNase behandelt werden.DEPC-Wasser ist eine häufig verwendete Lösung zum Auflösen von RNA.Lassen Sie uns über die richtige Zubereitungsmethode von DEPC-Wasser sprechen (denken Sie daran, das kommerzielle DEPC beim Kauf neu zu verpacken).

DEPC im Verhältnis 1:1000 zu Reinstwasser hinzufügen, gut schütteln, über Nacht bei 37 °C stehen lassen und bei 121 °C unter hoher Temperatur und hohem Druck 15 Minuten lang sterilisieren.DEPC-Wasser kann in 1-ml-Aliquots bei -20 °C gelagert werden.

Zusammenfassend lässt sich abschließend sagen: Niedrige Temperatur ist der Schlüssel, Verbrauchsmaterialien werden gut gehandhabt, volle Bewaffnung und weniger Gerede!

So, das war's mit der heutigen Strategie.Ich wünsche Ihnen die von Ihnen erwähnte RNA-Konzentration und Reinheit.Beide A260/A280 sind 2.0!!!

Natürlich, wenn Sie a verwendenRNA-Extraktionskit für den Betrieb bei Raumtemperatur, treten die oben genannten Probleme möglicherweise nicht auf.

Beim Betrieb bei Raumtemperatur ohne Zugabe von DNase wird die Gesamt-RNA aus Zellen in 11 Minuten und die Gesamt-RNA aus tierischen Geweben oder Pflanzen in 30 Minuten extrahiert.

Für Probemuster wenden Sie sich bitte an:overseas@foregene.com

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