Die quantitative Fluoreszenz-PCR (auch bekannt als TaqMan-PCR, im Folgenden als FQ-PCR bezeichnet) ist eine neue quantitative Nukleinsäuretechnologie, die 1995 von PE (Perkin Elmer) in den Vereinigten Staaten entwickelt wurde. Diese Technologie basiert auf der herkömmlichen PCR durch Zugabe fluoreszierend markierter Sonden.Im Vergleich zur flexiblen PCR bietet die FQ-PCR viele Vorteile bei der Umsetzung ihrer quantitativen Funktion.In diesem Artikel sollen die Eigenschaften, Prinzipien, Methoden und Anwendungen der Technologie kurz beschrieben werden.
1 Funktionen
Die FQ-PCR weist nicht nur die hohe Empfindlichkeit der gewöhnlichen PCR auf, sondern kann aufgrund der Anwendung von Fluoreszenzsonden auch die Änderung des Fluoreszenzsignals während der PCR-Amplifikation über das photoelektrische Leitungssystem direkt erfassen, um quantitative Ergebnisse zu erhalten, wodurch viele Mängel der herkömmlichen PCR überwunden werden, sodass sie auch die hohe Spezifität der DNA-Hybridisierung und die hohe Genauigkeit der Spektroskopietechnologie aufweist.
Beispielsweise müssen allgemeine PCR-Produkte durch Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung mit ultraviolettem Licht oder durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung beobachtet werden.Dies erfordert nicht nur mehrere Instrumente, sondern kostet auch Zeit und Mühe.Die verwendeten Ethidiumbromid-Färbemittel sind schädlich für den menschlichen Körper, und diese komplizierten experimentellen Verfahren bieten die Möglichkeit von Verschmutzung und falsch positiven Ergebnissen.Allerdings muss bei der FQ-PCR der Deckel während der Probenbeladung nur einmal geöffnet werden, und der anschließende Prozess ist ein vollständig geschlossener Röhrchenbetrieb, der keine PCR-Nachbearbeitung erfordert, wodurch viele Nachteile herkömmlicher PCR-Vorgänge vermieden werden.Das Experiment verwendet im Allgemeinen den von der Firma PE entwickelten PCR-Thermocycler ABI7100.
Das Instrument weist die folgenden Eigenschaften auf: ① Breite Anwendung: Es kann zur Quantifizierung von DNA- und RNA-PCR-Produkten, zur Genexpressionsforschung, zum Nachweis von Krankheitserregern und zur Optimierung von PCR-Bedingungen verwendet werden.② Einzigartiges quantitatives Prinzip: Bei Verwendung fluoreszierend markierter Sonden wird die Fluoreszenzmenge mit dem PCR-Zyklus nach der Laseranregung akkumuliert, um den Zweck der Quantifizierung zu erreichen.③ Hohe Arbeitseffizienz: Eingebauter 9600 PCR-Thermocycler, computergesteuert 1 bis 2 Stunden, um die Amplifikation und Quantifizierung von 96 Proben automatisch und synchron abzuschließen.④ Keine Gelelektrophorese erforderlich: Die Probe muss nicht verdünnt und einer Elektrophorese unterzogen werden. Verwenden Sie einfach eine spezielle Sonde, um sie direkt im Reaktionsgefäß nachzuweisen.⑤Keine Verschmutzung in der Rohrleitung: Das einzigartige, vollständig geschlossene Reaktionsrohr und das fotoelektrische Leitungssystem werden übernommen, sodass kein Grund zur Sorge über Verschmutzung besteht.⑥Die Ergebnisse sind reproduzierbar: Der quantitative Dynamikbereich beträgt bis zu fünf Größenordnungen.Daher wurde diese Technologie seit ihrer erfolgreichen Entwicklung von vielen wissenschaftlichen Forschern geschätzt und in vielen Bereichen eingesetzt.
2 Prinzipien und Methoden
Das Funktionsprinzip der FQ-PCR besteht darin, die 5′→3′-Exonukleaseaktivität des Taq-Enzyms zu nutzen, um dem PCR-Reaktionssystem eine fluoreszierend markierte Sonde hinzuzufügen.Die Sonde kann spezifisch mit der in der Primersequenz enthaltenen DNA-Matrize hybridisieren.Das 5'-Ende der Sonde ist mit dem Fluoreszenzemissionsgen FAM (6-Carboxyfluorescein, Fluoreszenzemissionspeak bei 518 nm) und das 3'-Ende mit der Fluoreszenzlöschgruppe TAMRA (6-Carboxytetramethylrhodamin, Fluoreszenzemissionspeak bei 582 nm) markiert. Der 3'-Anfang der Sonde ist phosphoryliert, um zu verhindern, dass die Sonde während der PCR-Amplifikation verlängert wird.Wenn die Sonde intakt bleibt, unterdrückt die Löschgruppe die Fluoreszenzemission der emittierenden Gruppe.Sobald die emittierende Gruppe von der Löschgruppe getrennt ist, wird die Hemmung aufgehoben und die optische Dichte bei 518 nm nimmt zu und wird vom Fluoreszenzdetektionssystem erfasst. In der Renaturierungsphase hybridisiert die Sonde mit der Matrizen-DNA und das Taq-Enzym bewegt sich in der Verlängerungsphase entlang der DNA-Matrize mit der Verlängerung des Primers.Wenn die Sonde abgeschnitten wird, wird der Löscheffekt aufgehoben und das Fluoreszenzsignal wird freigesetzt.Jedes Mal, wenn die Vorlage kopiert wird, wird eine Sonde abgeschnitten, was mit der Freisetzung eines Fluoreszenzsignals einhergeht.Da zwischen der Anzahl der freigesetzten Fluorophore und der Anzahl der PCR-Produkte eine Eins-zu-eins-Beziehung besteht, kann diese Technik zur genauen Quantifizierung der Vorlage verwendet werden.Das Versuchsgerät verwendet im Allgemeinen den von der Firma PE entwickelten PCR-Thermocycler ABI7100, es können jedoch auch andere Thermocycler verwendet werden.Wenn für das Experiment das Reaktionssystem ABI7700 verwendet wird, können die quantitativen Ergebnisse nach Abschluss der Reaktion direkt durch Computeranalyse ermittelt werden.Wenn Sie andere Thermocycler verwenden, müssen Sie einen Fluoreszenzdetektor verwenden, um gleichzeitig das Fluoreszenzsignal im Reaktionsgefäß zu messen und RQ+, RQ- und △RQ zu berechnen.RQ+ stellt das Verhältnis der Lumineszenzintensität der Fluoreszenzemissionsgruppe des Probenröhrchens zur Lumineszenzintensität der Löschgruppe dar, RQ- stellt das Verhältnis der beiden im Blindröhrchen dar, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) stellt das Ausmaß der Fluoreszenzsignaländerung während der PCR dar. Nach der Datenverarbeitung können quantitative Ergebnisse erhalten werden.Durch die Einführung fluoreszierender Sonden wird die Spezifität des Experiments deutlich verbessert.Das Sondendesign sollte im Allgemeinen die folgenden Bedingungen erfüllen: ①Die Länge der Sonde sollte etwa 20–40 Basen betragen, um die Spezifität der Bindung sicherzustellen.②Der Gehalt an GC-Basen liegt zwischen 40 % und 60 %, um eine Duplizierung einzelner Nukleotidsequenzen zu vermeiden.③ Vermeiden Sie Hybridisierung oder Überlappung mit Primern.④ Die Stabilität der Bindung zwischen Sonde und Matrize ist größer als die Stabilität der Bindung zwischen Primer und Matrize, daher sollte der Tm-Wert der Sonde mindestens 5 °C höher sein als der Tm-Wert des Primers.Darüber hinaus haben die Konzentration der Sonde, die Homologie zwischen Sonde und Matrizensequenz sowie der Abstand zwischen Sonde und Primer einen Einfluss auf die experimentellen Ergebnisse.
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Zeitpunkt der Veröffentlichung: 15. Okt. 2021
