RT-qPCR ist das grundlegende Experiment der Molekularbiologie und jeder muss damit vertraut sein.Es umfasst im Wesentlichen drei Schritte: RNA-Extraktion, reverse Transkription in cDNA und quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR.Es hilft nicht, was ist los?Es ist wahrscheinlich, dass ein Problem vorliegtdas Reverse-Transkription-Experiment!Obwohl es den Anschein hat, dass das Reverse-Transkription-Experiment nur RNA, dNTP, Primer usw. hinzufügen mussumgekehrte Transkriptasein das Zentrifugenröhrchen geben und gut mischen, aber im eigentlichen Betrieb müssen noch viele Details beachtet werden.Lernen wir es kennen!

Wie beurteilt man die Qualität der RNA?
Um cDNA zu erhalten, ist die Qualität der RNA entscheidend!Die RNA-Qualität lässt sich hauptsächlich anhand zweier Aspekte erkennen:
(1) RNA-Integrität:Die RNA-Integrität kann durch Agarosegelelektrophorese überprüft werden. Am Beispiel von Eukaryoten weist die gesamte Gesamt-RNA drei klare Banden auf, die Molekulargewichte von groß nach klein sind 28S, 18S und 5S, und 28S ist doppelt so hell wie 18S;Wenn drei Banden zu sehen sind, der Bandentyp jedoch verschwommen ist oder Diffusion vorliegt, bedeutet dies, dass die RNA teilweise abgebaut ist.Führen Sie zu diesem Zeitpunkt bitte sofort die Reverse-Transkriptionsreaktion durch und erhöhen Sie die Vorlageneingabe entsprechend;Wenn nur eine Bande mit geringem Molekulargewicht oder keine Bande zu sehen ist, ist die RNA vollständig abgebaut und muss erneut extrahiert werden.Agilent 2100 zeigt die Integrität der RNA mit Peakdiagramm und RIN-Wert an.Wenn die Nukleinsäure intakt ist, ist die Grundlinie des Elektropherogramms flach;Wenn die Nukleinsäure stark abgebaut ist, ist die Grundlinie ungleichmäßig und es treten mehr Abbauspitzen auf;Der RIN-Wert spiegelt die Integrität der RNA wider. Er liegt im Bereich von 0 bis 10. Je größer der Wert, desto besser ist die Qualität der RNA.Nun, je höher der Grad der Vollständigkeit.
(2) Reinheit der RNA:Das Verhältnis von OD260/280 kann durch UV-Spektrophotometrie erfasst werden.Liegt das Verhältnis OD260/280 zwischen 1,9 und 2,1, ist die Reinheit sehr gut.
Restliche genomische DNA kann zu ungenauen quantitativen Ergebnissen führen
Wenn RNA extrahiert wird, kann die erhaltene RNA mit nicht gereinigter genomischer DNA (gDNA) vermischt werden.Daher wird die cDNA nach der reversen Transkription auch mit gemischtgDNA.Während des DownstreamsqPCRReaktion,cDNAund gDNA können gleichzeitig amplifiziert werden, was zu einem relativ kleinen CT-Wert führt, sodass die Ergebnisse verzerrt sein können.
Was sollen wir also in dieser Situation tun?Vorgeneschlägt vor:
(1) Führen Sie eine Genomreinigung an der umgekehrten RNA durch, die durch Säulenextraktion während der RNA-Extraktion entfernt werden kann.
(2) Behandeln Sie die extrahierte RNA mit DNaseI , aber terminiere es mit EDTA;
von Reverse-Transkriptions-Reagenzienmit Genom-Clearing-Modulen;

Wie wählt man Primer für die Reverse Transkription aus?
Reverse-Transkriptions-Primer beeinflussen auch das Ergebnis der Reverse-Transkriptions-Reaktion.Sie können je nach den spezifischen Umständen des Experiments Zufallsprimer, Oligo dT oder genspezifische Primer für die Reverse Transkription wählen:
(1) Spezifische Transkripte: genspezifische Primer werden empfohlen;
(2) Lange Fragmenttranskripte: Oligo dT/genspezifische Primer werden empfohlen;
(3) Interne Fragmente von Langsegment-Transkripten: genspezifische Primer/Zufallsprimer/Zufallsprimer + Oligo dT.Wenn das nachfolgende qPCR-Experiment durchgeführt wird, kann Oligo dT nicht allein verwendet werden, da die alleinige Verwendung von Oligo dT zu einer Verzerrung des 3′-Endes führen kann, was zu ungenauen Ergebnissen des qPCR-Experiments führt.
(4) miRNA: Es können Stem-Loop-Primer oder Tailing-Primer verwendet werden.

Wie oft sollte die cDNA des Reverse-Transkriptionsprodukts zur Quantifizierung verdünnt werden?
Nach Erhalt der cDNA des Reverse-Transkriptionsprodukts ist es sehr wichtig, wie oft die cDNA für qPCR-Experimente verdünnt werden sollte.Wenn die cDNA-Konzentration zu hoch oder zu niedrig ist, kann die Amplifikationseffizienz beeinträchtigt werden.Kann die cDNA-Konzentration gemessen werden und wie sollte dies erfolgen?
(1) Die cDNA-Konzentration des Reverse-Transkriptionsprodukts kann nicht gemessen werden, da das Reverse-Transkriptionsprodukt zusätzlich zum cDNA-Produkt auch Restpuffer der Reverse-Transkription, Reverse-Transkriptase, Primer usw. enthält, die die Ergebnisse der Konzentrationsmessung beeinträchtigen und zu abnormalen OD260/280-, OD260/230-Verhältnissen führen und daher nicht die tatsächliche cDNA-Ausbeute widerspiegeln.Zu diesem Zeitpunkt werden einige Freunde sagen, dann werde ich die Konzentration nach der Reinigung messen;Hier möchte Foregene daran erinnern, dass die Reinigung der cDNA nicht empfohlen wird, da die Länge der durch die Umkehrung erhaltenen cDNA unterschiedlich ist und die kurze cDNA bei der Reinigung verloren geht.
(2) Was also tun?Vor dem qPCR-Experiment kann durch das Vorexperiment der Verdünnungsgradient der cDNA ermittelt werden.Beispiel: Verwenden Sie cDNA-Stammlösung, 10-fache Verdünnung und 100-fache Verdünnung als Vorlagen für qPCR-Experimente und wählen Sie den Verdünnungsfaktor mit einem CT-Wert im Bereich von 18–28.

Wie sollten miRNAs revers transkribiert werden?
miRNA ist eine einzelsträngige kleine Molekül-RNA mit einer Größe von etwa 22 nt, die kein Protein kodiert.Aufgrund ihrer kurzen Länge ist es mit herkömmlichen qPCR-Methoden schwierig, sie direkt zu quantifizieren, daher ist es oft notwendig, miRNA zu verlängern;Zu den am häufigsten verwendeten Methoden der reversen Transkription für miRNA gehören die Stamm-Loop-Methode und die Tailing-Methode.
Bei der Stem-Loop-Methode wird die miRNA durch Hinzufügen von Stem-Loop-Primern verlängert.Diese Nachweismethode weist eine höhere Empfindlichkeit und Spezifität auf, der Nachweisdurchsatz ist jedoch gering.Eine Reverse Transkription kann nur eine miRNA und eine interne Referenz erkennen;Die Methode zum Hinzufügen eines Schwanzes besteht aus zwei Schritten. Sie wird durch die gemeinsame Wirkung zweier Enzyme vervollständigt, nämlich PolyA-Polymerase und Reverse Transkriptase.Die PolyA-Polymerase ist für das Hinzufügen von PolyA-Schwänzen zur miRNA verantwortlich, um deren Länge zu erhöhen, und die Reverse Transkriptase führt die Reverse Transkriptionsreaktion durch.Diese Methode weist einen hohen Nachweisdurchsatz auf und kann mehrere miRNAs und interne Referenzen in einer Reverse Transkription erkennen, die Sensitivität und Spezifität der Stamm-Loop-Methode sind jedoch gering.