Alle reden über das Prinzip des qRT-PCR-Experiments, das Primerdesign, die Ergebnisinterpretation usw., aber ich denke, ich sollte Ihnen die experimentelle Funktionsweise der qRT-PCR näher bringen.Es ist zwar klein, aber es geht um Ergebnisse.
Bevor wir qRT-PCR durchführen, müssen wir ein klares Verständnis unserer eigenen RNA und Betriebsmethoden haben.Schließlich zielen unsere Bemühungen darauf ab, Ergebnisse zu erzielen, und nicht nur auf das bloße Üben.Bevor wir also qRT-PCR durchführen, müssen wir die folgenden Probleme klären (von denen einige nur für SYBR gelten).
1 Sind Sie sicher, dass Ihre RNA nicht abgebaut ist?
NanoDrop 2000 kann nur die Konzentration und Reinheit von RNA erkennen, nicht jedoch die Integrität von RNA.
Der RNA-Wert (RNA Intesity Number) kann die Integrität der RNA widerspiegeln, die vom Agilent 2100 Bioanalyzer-System erkannt wird.
Abb. Schematische Darstellung der RIN-Werte für verschiedene RNA-Proben (Eukaryoten)
Allerdings verfügen Labore im Allgemeinen nicht über den Agilent 2100 Bioanalyzer.In diesem Fall können wir den Nachweis über Formaldehyd-Gel durchführen, der Bedarf an der Gesamtmenge an RNA ist jedoch hoch, sodass die schnellste Methode die Verwendung einer gewöhnlichen Gelelektrophorese ist.Es ist eine nukleasefreie Umgebung erforderlich, daher ist es notwendig, den Elektrophoresetank, die Solflasche, die Gelhalterung und den Kamm mit DEPC-Wasser zu spülen.Die Agarose ist außerdem nukleasefrei (solange sie frisch geöffnet ist), und der Ladepuffer sollte möglichst frisch geöffnet sein, mit 1,2 % Gel.
Beachten Sie, dass das Gel vollständig aufgelöst sein muss, da es sonst zu inhomogenen Banden kommt, wie in Probe 9 in der Abbildung gezeigt.Wenn die Spannung zu hoch ist oder zu lange läuft, entsteht Wärme und es kommt zum Abbau der RNA. Daher sollten Spannung und Zeit angemessen kontrolliert werden.Darüber hinaus kann der Gellauf auch weiter bestimmen, ob DNA-Rückstände in der Probe vorhanden sind, und beobachten, ob sich in der Dispensiermulde eine große Anzahl zurückgehaltener Banden befindet.
Figur.Gelelektrophorese-Nachweis von RNA
2 Sind Sie sich über die Konzentration Ihrer cDNA sicher?
Die Erfahrung der großen Brüder im Labor ist, dass die cDNA des 20-ul-Systems, die durch jede Inversion erhalten wird, direkt 20-fach verdünnt wird, während die Postdoktorandenschwestern 10-fach verdünnt werden.Normalerweise bin ich von der Situation abhängig.Da die Qualität der von jeder Person genannten RNA unterschiedlich ist, ist auch der Grad der Umkehrung unterschiedlich und die Umkehrungstechnologie ist möglicherweise nicht stabil.
Jedes Mal, wenn ich die umgekehrte cDNA erhalte, verdünne ich sie zunächst etwa dreimal und führe dann mithilfe des Housekeeping-Gens eine RT-PCR durch. Die Anzahl der Zyklen beträgt im Allgemeinen 25 Zyklen, um die spezifische Konzentration zu ermitteln und dann den endgültigen Verdünnungsfaktor zu bestimmen.
3 Sind Sie sicher, dass Ihre Grundierungen einfach zu verwenden sind?
Es kann die Schmelzkurve der qRT-PCR passieren, kostet aber trotzdem Geld.Labore, die nicht über viel Geld verfügen und viele Primer erhalten, können mithilfe einer gewöhnlichen RT-PCR prüfen, ob es sich um eine einzelne Bande handelt, und die Spezifität der Primer ermitteln.Sofern es dem Labor nicht an Geld mangelt, kann die Spezifität aller Primer einmalig anhand der Schmelzkurve ermittelt werden.
4 Sind Sie sicher, dass Ihre Versuchsbedingungen geeignet sind?
SYBR sollte vor starkem Licht geschützt werden. Versuchen Sie daher, das Deckenlicht auszuschalten, wenn Sie SYBR-Reagenz hinzufügen, und verwenden Sie nur schwaches Licht, um den Vorgang abzuschließen.
Lagern Sie SYBR bei 4 °C.Drehen Sie das Produkt bei der Verwendung vorsichtig auf und ab, um es gut zu vermischen und Schaumbildung zu vermeiden, und mischen Sie es nicht kräftig.
Manche jüngeren Schwestern malen gerne Markierungen auf die PCR-Tafel, aus Angst, die Proben zu verwechseln, was falsch ist.Da Ihre Markierungen sehr wahrscheinlich die Sammlung von Fluoreszenzsignalen beeinflussen, empfehle ich Schülern im Allgemeinen, experimentelle Notizbücher zu verwenden, um das Gedächtnis zu unterstützen, wie unten gezeigt.
Figur.qRT-PCR-Probenladediagramm
5 Sind Sie sicher, dass Sie es richtig machen?
Tragen Sie unbedingt Handschuhe, tragen Sie Handschuhe, tragen Sie Handschuhe und sagen Sie wichtige Dinge dreimal.
Um die Lichteinwirkung von SYBR zu reduzieren, füge ich persönlich gerne zuerst eine Vorlage hinzu, wie in der Abbildung unten gezeigt.Erfahrungsgemäß kann die Zugabe einer geringen Menge an Vorlage zu Stichprobenfehlern führen.Um den Fehler zu minimieren, der durch die Zugabe einer kleinen Menge Vorlage entsteht, verdoppele ich daher normalerweise die Probe noch einmal und verdoppele die Menge bei der Zugabe der Probe, um die Menge an hinzugefügtem H2O2 zu reduzieren.
Figur.Schematische Darstellung der qRT-PCR-Beladung
Anschließend konfigurieren Sie das qRT-PCR-System wie folgt.
Figur.Diagramm zur Vorbereitung des qRT-PCR-Systems
HINWEIS: Der Konfigurationsprozess muss auf Eis durchgeführt werden.
Nachdem Sie die Probe hinzugefügt haben, kleben Sie die transparente Versiegelungsfolie ein.Versuchen Sie, die Oberfläche der transparenten Versiegelungsfolie nicht mit Ihren Händen zu berühren, sondern bedienen Sie sich einfach von der Stelle auf beiden Seiten der Folie aus.Denn auch Fingerabdrücke können die Erfassung fluoreszierender Signale beeinträchtigen.Anschließend mit einer Zentrifuge 10 s lang bei niedriger Drehzahl schnell zentrifugieren, um zu verhindern, dass die Probe an der Wand hängt.
Verwandte Produkte:
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 28. April 2023
