Escherichia coli O157: H7-Nukleinsäure-Nachweiskit (PCR-Fluoreszenzsondenmethode/Lyophilisierung)
Kit-Beschreibung:
Katze nein.FP103
Es wird zum schnellen Nachweis und Screening von E. coli O157:H7 in Lebensmitteln, Futtermitteln, Wasserproben und Umweltproben verwendet.
Beschreibungen
Es wird genutzt fürSchneller Nachweis und Screening von E. coli O157:H7 in Lebensmitteln, Futtermitteln, Wasserproben und Umweltproben.
[Prüfprinzip]
Nach dem Prinzip der Fluoreszenz-PCR-Technologie werden spezifische Primer und Taqman-Sonden für das spezifische Gen von Escherichia coli O157: H7 entwickelt und mit einem Fluoreszenz-PCR-Instrument nachgewiesen, um den Nachweis von Escherichia coli O157: H7 zu ermöglichen. Qualitativer DNA-Nachweis.
Inhalt des Kits
Hinweis: ROX-Kanalsonde ist nicht im Lieferumfang enthalten.
| CKomponenten | Spezifikation | QMenge |
| Puffer A | Rohr | 1 |
| Puffer B | Rohr | 1 |
| Positive Kontrolle | Rohr | 1 |
| Negativkontrolle | Rohr | 1 |
Erwartete Nutzung
Es wird genutzt für Schneller Nachweis und Screening von E. coli O157:H7 in Lebensmitteln, Futtermitteln, Wasserproben und Umweltproben.
Lagerbedingungen und Ablaufdatum
Bei -20 °C im Dunkeln lagern und wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden.
Die Gültigkeitsdauer beträgt 12Monate, das Produktionsdatum ist auf der Umverpackung angegeben.
Instrumente und Verbrauchsmaterialien
Fluoreszierendes quantitatives PCR-Gerät, Pipettenpistole und passende Spitzen, Vortexschüttler, Minizentrifuge.
Verwendung
1. Probenverarbeitung
1.1 Probentyp: Dieses Kit eignet sich für Lebensmittel-, Futtermittel-, Wasserproben und andere Proben, bei denen der Verdacht besteht, dass sie mit Escherichia coli O157:H7 kontaminiert sind.Bei tief verarbeiteten Fleischprodukten, Getränken und anderen Substanzen, die Pigmente enthalten, müssen diese gespült werden, um eine Beeinträchtigung der Fluoreszenzsignalerfassung zu vermeiden.
1.2 Probenverarbeitung: Informationen zur Probenvorbereitung, Anreicherungskultur und Isolierung von Escherichia coli O157: H7 finden Sie in „GB 4789.10-2016 Food Safety National Standard Food Microbiological Examination of Escherichia coli O157: H7 Test“.
- NExtraktion von Ukleinsäure
Nehmen Sie 20 ml Anreicherungslösung in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 200 μl mikrobielles Lysat hinzu (zusätzliches Kit ist erforderlich), 30 Sekunden lang vortexen, kurz zentrifugieren und beiseite stellen.
Anmerkungen: Die Extraktion der Nukleinsäure aus dem Lysat sollte innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen sein und kann nicht über einen längeren Zeitraum gelagert werden.
3. Nukleinsäureamplifikation
3.1 Schalten Sie das fluoreszierende quantitative PCR-Gerät zur Verwendung ein.
Puffer A und Puffer B aus dem Kit entnehmen, gründlich schmelzen und kurz zentrifugieren.Geben Sie 18 μL Puffer A und 2 μL Puffer B in jedes PCR-Reaktionsröhrchen.Geben Sie dann jeweils 5 ml der Negativkontrolle, der extrahierten Nukleinsäure und der Positivkontrolle in die PCR-Reaktionsröhrchen, verschließen Sie die Röhrchen und zentrifugieren Sie kurz.
3.3 Übertragen Sie das PCR-Reaktionsröhrchen in ein fluoreszierendes PCR-Gerät und führen Sie Amplifikationsexperimente mit den folgenden Verfahren durch: Wählen Sie 25 ml für das Reaktionssystem, sammeln Sie Fluoreszenzsignale bei 60 °C für jeden Zyklus und wählen Sie FAM als Detektionskanal.
| Schritt | Programm | Anzahl der Zyklen |
| 1 | 37℃ 5min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ 30s (Fluoreszenz sammeln) |
Leitfäden zur Problemanalyse
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Es kann keine RNA extrahiert werden oder die Ausbeute an Nukleinsäure ist gering
Normalerweise gibt es viele Faktoren, die die Rückgewinnungseffizienz beeinflussen, wie zum Beispiel: RNA-Gehalt der Probe, Betriebsmethode, Elutionsvolumen usw.。
Analyse häufiger Ursachen:
1. Eisbad oder Zentrifugation bei niedriger Temperatur (4 ° C) während des Betriebs.
Vorschlag: Betrieb bei Raumtemperatur (15–25 °C), niemals Eisbad und Zentrifuge bei niedriger Temperatur.
2. Unsachgemäße oder zu lange Probenlagerung.
Vorschlag: Lagern Sie die Proben bei -80 °C oder frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein und vermeiden Sie eine wiederholte Verwendung durch Einfrieren und Auftauen.Versuchen Sie, frisch gesammelte Proben für die RNA-Extraktion zu verwenden.
3. Unzureichende Probenlyse
Empfehlung: Bitte stellen Sie sicher, dass die Probe und die Arbeitslösung (lineares Acrylamid) gründlich gemischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur (15–25 °C) inkubiert wurden.
4.Der Eluent wurde falsch hinzugefügt
Empfehlung: Stellen Sie sicher, dass RNase-Free ddH2O in die Mitte der Membran der Reinigungssäule gegeben wird
5. Falsches Volumen an wasserfreiem Ethanol im Puffer viRW2
Vorschlag: Bitte befolgen Sie die Anweisungen, geben Sie die richtige Menge wasserfreies Ethanol zum Puffer viRW2 hinzu und mischen Sie alles gut, bevor Sie das Kit verwenden.
6. Unsachgemäße Probenverwendung.
Vorschlag: 200 µl Probe pro 500 µl Puffer viRL.Ein zu großes Probenvolumen führt zu einer verringerten RNA-Extraktionsrate.
7. Falsches Elutionsvolumen oder unvollständige Elution.
Vorschlag: Das Eluentenvolumen der Reinigungssäule beträgt 30–50 μl;Wenn der Elutionseffekt nicht zufriedenstellend ist, wird die Zugabe von vorgewärmtem RNase-Free ddH empfohlen2O und verlängern Sie die Zeit bei Raumtemperatur, z. B. 5-10 Minuten
8. Die Reinigungssäule weist nach dem Spülen im Puffer viRW2 Ethanolrückstände auf.
Vorschlag: Wenn nach dem Spülen im Puffer viRW2 und der Zentrifugation im leeren Röhrchen für 2 Minuten noch Ethanol zurückbleibt, kann die Reinigungssäule nach der Zentrifugation im leeren Röhrchen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur belassen werden, um das restliche Ethanol vollständig zu entfernen.
Der Abbau gereinigter RNA-Moleküle
Die Qualität der gereinigten RNA hängt von Faktoren wie Probenlagerung, RNase-Kontamination und Betrieb ab.
Analyse häufiger Ursachen:
1. Die gesammelten Proben wurden nicht rechtzeitig gespeichert.
Vorschlag: Wenn die Probe nicht rechtzeitig nach der Entnahme verwendet wird, lagern Sie sie bitte sofort bei -80 °C oder flüssigem Stickstoff.Versuchen Sie für die Extraktion von RNA-Molekülen nach Möglichkeit frisch gesammelte Proben zu verwenden.
2. Die gesammelten Proben wurden wiederholt eingefroren und aufgetaut.
Empfehlung: Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen (höchstens einmal) während der Probenentnahme und -lagerung, da sonst die Ausbeute an Nukleinsäure abnimmt.
3.RNase wurde im Operationssaal eingeführt oder es wurden keine Einweghandschuhe, Masken usw. getragen.
Vorschlag: Das Experiment zur Extraktion von RNA-Molekülen wird am besten in einem separaten RNA-Operationsraum durchgeführt und der Experimentiertisch wird vor dem Experiment gereinigt.Tragen Sie während des Experiments Einweghandschuhe und -masken, um einen durch die RNase-Einführung verursachten RNA-Abbau zu vermeiden.
4. Das Reagenz wird während der Verwendung durch RNase kontaminiert.
Vorschlag: Ersetzen Sie es durch ein neues Virus-RNA-Isolierungskit für entsprechende Experimente.
5. Die RNase-Kontamination der Zentrifugenröhrchen, Pipettenspitzen usw. Vorschlag: Stellen Sie sicher, dass die Zentrifugenröhrchen, Pipettenspitzen und Pipetten alle RNase-frei sind.
Die gereinigten RNA-Moleküle wirkten sich auf nachgelagerte Experimente aus
Die durch die Reinigungssäule gereinigten RNA-Moleküle beeinträchtigen nachfolgende Experimente, wenn zu viele Salzionen oder Proteine vorhanden sind, wie zum Beispiel: Reverse Transkription, Northern Blot usw.。
1. In den eluierten RNA-Molekülen sind noch Salzionen vorhanden.
Empfehlung: Stellen Sie sicher, dass dem Puffer viRW2 das richtige Volumen an wasserfreiem Ethanol zugesetzt wurde, und waschen Sie die Reinigungssäule zweimal entsprechend der korrekten Zentrifugationsgeschwindigkeit in der Bedienungsanleitung. Wenn noch Salzionen übrig sind, können Sie Puffer viRW2 in die Reinigungssäule geben und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen lassen.Führen Sie dann eine Zentrifugation durch, um die Verunreinigung durch Salzionen weitestgehend zu entfernen
2. In den eluierten RNA-Molekülen ist noch Ethanol enthalten
Vorschlag: Sobald Sie sich vergewissert haben, dass die Reinigungssäulen mit Puffer viRW2 gespült wurden, führen Sie eine Zentrifugation mit leerem Röhrchen gemäß der Zentrifugengeschwindigkeit in der Bedienungsanleitung durch.Sollte noch Ethanol übrig sein, kann es nach einer Leerröhrchenzentrifugation 5 Minuten bei Raumtemperatur belassen werden, um das restliche Ethanol weitestgehend zu entfernen.
Bedienungsanleitung:
Bedienungsanleitung für das virale RNA-Isolierungskit
