Sterilisation von Pipettenspitzen und EP-Röhrchen etc.

1. Bereiten Sie 0,1 % (ein Tausendstel) DEPC (hochgiftige Substanz) mit entionisiertem Wasser vor, verwenden Sie es vorsichtig in einem Abzug und lagern Sie es lichtgeschützt bei 4 °C.

DEPC-Wasser ist reines Wasser, das mit DEPC behandelt und durch hohe Temperatur und hohen Druck sterilisiert wird.Getestet auf RNase-, DNase- und Proteinase-frei.

2. Geben Sie die Pipettenspitze und das EP-Röhrchen in 0,1 % DEPC und stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze und das EP-Röhrchen mit 0,1 % DEP gefüllt sind.

3. Vor Licht schützen und über Nacht stehen lassen (12–24 Stunden).

4. Die Box mit der Spitze und dem EP-Röhrchen muss nicht in DEPC eingeweicht werden.Nachdem Sie das DEPC-Wasser grob aus der Spitze oder dem EP-Röhrchen entfernt haben, packen Sie es ein und wickeln Sie es ein.

5. 121 Grad Celsius, 30 Min

6. 180 Grad Celsius, mehrere Stunden trocknen (mindestens 3 Stunden)

Kein Tee.Tragen Sie beim Umgang mit DEPC Latexhandschuhe und -masken!b, oder ohne DEPC-Sterilisation, 130 ℃, 90-minütiger Autoklav (viele Laboratorien zweimal Hochtemperatursterilisation)

Überlegungen zur RNA-Extraktion

Zwei Hauptphänomene des Versagens der Gewebe-RNA-Isolierung

RNA-Abbau und Rückstände von Verunreinigungen im Gewebe,Was den Abbau betrifft, schauen wir uns zunächst an, warum aus kultivierten Zellen extrahierte RNA nicht leicht abgebaut wird.Bestehende RNA-Extraktionsreagenzien enthalten alle Komponenten, die RNase schnell hemmen.Geben Sie das Lysat zu den kultivierten Zellen und mischen Sie es einfach. Alle Zellen können gründlich mit dem Lysat vermischt werden und die Zellen werden vollständig lysiert.Nachdem die Zellen lysiert sind, hemmen die Wirkstoffe im Lysat sofort die intrazelluläre RNase, sodass die RNA intakt bleibt.Das heißt, da die kultivierten Zellen leicht und vollständig mit dem Lysat in Kontakt kommen, wird ihre RNA nicht leicht abgebaut;Andererseits wird die RNA im Gewebe leicht abgebaut, da die Zellen im Gewebe nicht schnell mit dem Lysat in Kontakt kommen.aufgrund ausreichenden Kontakts.So,Unter der Annahme, dass es eine Möglichkeit gibt, das Gewebe in eine einzelne Zelle umzuwandeln und gleichzeitig die RNA-Aktivität zu hemmen, könnte das Problem des Abbaus vollständig gelöst werden.

Das Mahlen mit flüssigem Stickstoff ist die effektivste Methode dieser Art.Das Mahlverfahren mit flüssigem Stickstoff ist jedoch sehr problematisch, insbesondere wenn die Anzahl der Proben groß ist.Daraus entstand das Nächstbeste: der Homogenisator.DerHomogenisatorDie Methode berücksichtigt nicht die Frage, wie die RNase-Aktivität gehemmt wird, bevor Zellen mit dem Lysat in Kontakt kommen, sondern geht vielmehr davon aus, dass die Geschwindigkeit der Gewebezerstörung schneller ist als die Geschwindigkeit, mit der intrazelluläre RNase RN abbaut.

Die Wirkung des elektrischen Homogenisators ist besser,und die Wirkung des Glashomogenisators ist gering, aber im Allgemeinen kann die Homogenisatormethode das Abbauphänomen nicht verhindern.Wenn die Extraktion nachlässt, sollte daher der ursprüngliche elektrische Homogenisator zum Mahlen mit flüssigem Stickstoff verwendet werden;Der ursprüngliche Glashomogenisator sollte gegen einen elektrischen Homogenisator ausgetauscht oder direkt mit flüssigem Stickstoff gemahlen werden.Das Problem ist nahezu zu 100 % machbar.werde gelöst.

Das Problem der Verunreinigungsrückstände, das sich auf nachfolgende Experimente auswirkt, hat vielfältigere Ursachen als den Abbau, und die Lösungen sind entsprechend unterschiedlich.Abschließend,Kommt es zu einer Degradation oder zu Restverunreinigungen im Gewebe, muss die Extraktionsmethode/das Reagenz für das spezifische Versuchsmaterial optimiert werden.Sie müssen Ihre wertvollen Proben nicht zur Optimierung verwenden: Sie können einige kleine Tiere wie Fisch/Hühner vom Markt kaufen, den entsprechenden Teil des Materials für die RNA-Extraktion und den anderen Teil für die Proteinextraktion – vermahlen mit Mund-, Magen- und Darmextrakt – nehmen.

Die Ziel-RNA der extrahierten RNA wird für verschiedene Folgeexperimente verwendet und weist unterschiedliche Qualitätsanforderungen auf

Der Aufbau einer cDNA-Bibliothek erfordert RNA-Integrität ohne Rückstände von Enzymreaktionsinhibitoren;Northern erfordert eine höhere RNA-Integrität und geringere Anforderungen an Rückstände von Enzymreaktionsinhibitoren;RT-PCR erfordert keine zu hohe RNA-Integrität,hemmt aber Enzymreaktionen.Die Rückstandsauflagen sind streng.Die Eingabe bestimmt die Ausgabe;Jedes Mal, wenn das Ziel darin besteht, RNA mit höchster Reinheit zu erhalten, kostet es Menschen und Geld.

Sammlung/Lagerung von Proben

Faktoren, die den Abbau beeinflussen Nachdem die Probe den lebenden Körper bzw. die ursprüngliche Wachstumsumgebung verlässt, beginnen die endogenen Enzyme in der Probe mit dem Abbau der RNA.und die Abbaurate hängt vom Gehalt an endogenen Enzymen und der Temperatur ab.Traditionell gibt es nur zwei Möglichkeiten, die endogene Enzymaktivität vollständig zu hemmen: Lysat sofort zugeben und gründlich und schnell homogenisieren;In kleine Stücke schneiden und sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren.Beide Ansätze erfordern eine schnelle Bedienung.Letzteres ist für alle Proben geeignet, während Ersteres nur für Gewebe mit geringem Gehalt an Zellen und endogenen Enzymen geeignet und leichter zu homogenisieren ist.Insbesondere Pflanzengewebe, Leber, Thymusdrüse, Bauchspeicheldrüse, Milz, Gehirn, Fett, Muskelgewebe usw. werden vor dem Fortfahren am besten mit flüssigem Stickstoff eingefroren.

Fragmentierung und Homogenisierung von Proben

Faktoren, die den Abbau und die Ausbeute beeinflussen, sind Fragmentierung der Probezur gründlichen Homogenisierung, was der vollständigen und vollständigen Freisetzung von RNA dient.Zellen können direkt homogenisiert werden, ohne aufgebrochen zu werden.Gewebe können erst nach dem Aufbrechen homogenisiert werden.Hefen und Bakterien müssen mit entsprechenden Enzymen aufgebrochen werden, bevor sie homogenisiert werden können.Gewebe mit geringerem endogenem Enzymgehalt und leichterer Homogenisierung können im Lysat durch einen Homogenisator auf einmal zerkleinert und homogenisiert werden;Pflanzengewebe, Leber, Thymus, Bauchspeicheldrüse, Milz, Gehirn, Fett, Muskelgewebe und andere Proben. Sie enthalten entweder viele endogene Enzyme oder lassen sich nicht leicht homogenisieren.Daher müssen Gewebeaufschluss und Homogenisierung getrennt durchgeführt werden.Die zuverlässigste und produktivste Methode zur Fragmentierung ist das Mahlen mit flüssigem Stickstoff, und die zuverlässigste Methode zur Homogenisierung ist die Verwendung eines elektrischen Homogenisators.Ein besonderer Hinweis zum Mahlen mit flüssigem Stickstoff: Die Probe darf während des gesamten Mahlvorgangs nicht aufgetaut werden, da endogene Enzyme im gefrorenen Zustand eher funktionieren.

Auswahl des Lysats

Beeinträchtigung der Bedienfreundlichkeit und der Faktoren verbleibender endogener Verunreinigungen. Die üblicherweise verwendeten Lyselösungen können die Aktivität von RNase nahezu hemmen.Daher ist der entscheidende Punkt bei der Auswahl einer Lyselösung die Kombination mit der Reinigungsmethode.Es gibt eine Ausnahme:Bei Proben mit einem hohen Gehalt an endogenen Enzymen wird die Verwendung eines phenolhaltigen Lysats empfohlen, um die Fähigkeit zur Inaktivierung endogener Enzyme zu erhöhen.

Wahl der Reinigungsmethode

Faktoren, die restliche endogene Verunreinigungen und Extraktionsgeschwindigkeit beeinflussen. Bei sauberen Proben wie Zellen können mit fast jeder verfügbaren Reinigungsmethode zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden.Aber auch für viele andere Proben, insbesondere solche mit einem hohen Anteil an Verunreinigungen wie Pflanzen, Leber, Bakterien usw., ist die Wahl einer geeigneten Reinigungsmethode entscheidend.Die Säulenzentrifugalreinigungsmethode hat eine hohe Extraktionsgeschwindigkeit und kann Verunreinigungen, die die nachfolgende enzymatische Reaktion der RNA beeinträchtigen, effektiv entfernen, ist aber teuer (Foregene kann kostengünstige Kits anbieten, weitere Details klicken).Hier);Mit wirtschaftlichen und klassischen Reinigungsmethoden wie der LiCl-Fällung können ebenfalls zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden, allerdings ist die Betriebszeit lang..

„Drei Disziplinen und acht Aufmerksamkeiten“ für die RNA-Extraktion

Disziplin 1:Machen Sie Schluss mit der Verunreinigung durch exogene Enzyme.

Anmerkung 1:Tragen Sie unbedingt Masken und Handschuhe.

Anmerkung 2:Die am Experiment beteiligten Zentrifugenröhrchen, Spitzenköpfe, Pipettenstäbe, Elektrophoresetanks und Versuchsbänke sollten gründlich entsorgt werden.

Notiz 3:Die am Experiment beteiligten Reagenzien/Lösungen, insbesondere Wasser, müssen RNase-frei sein.

Disziplin 2:Blockieren Sie die Aktivität endogener Enzyme

Anmerkung 4:Wählen Sie eine geeignete Homogenisierungsmethode.

Anmerkung 5:Wählen Sie ein geeignetes Lysat.

Anmerkung 6:Kontrollieren Sie die Ausgangsmenge der Probe.

Disziplin 3:Klären Sie Ihren Extraktionszweck

Anmerkung 7:Wenn sich ein Lysatsystem der maximalen Ausgangsprobenmenge nähert, sinkt die Erfolgsrate der Extraktion stark.

Anmerkung 8:Das einzige wirtschaftliche Kriterium für eine erfolgreiche RNA-Extraktion ist der Erfolg in nachfolgenden Experimenten, nicht der Ertrag.

Top 10 Quellen der RNase-Kontamination

1. Finger sind die erste Quelle exogener Enzyme, daher müssen Handschuhe häufig getragen und ausgetauscht werden.Darüber hinaus müssen auch Masken getragen werden, denn auch die Atmung ist eine wichtige Enzymquelle.Ein zusätzlicher Vorteil des Tragens einer Handschuhmaske besteht darin, den Experimentator zu schützen.

2. Pipettenspitzen, Zentrifugenröhrchen, Pipetten – RNase kann nicht durch Sterilisation allein inaktiviert werden, daher sollten Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen mit DEPC behandelt werden, auch wenn sie als DEPC-behandelt gekennzeichnet sind.Verwenden Sie am besten eine Spezialpipette und wischen Sie diese vor dem Gebrauch mit einem Wattebausch mit 75 % Alkohol ab, insbesondere den Stab.Achten Sie außerdem darauf, keinen Kopfentferner zu verwenden.

3. Das Wasser/der Puffer muss frei von RNase-Kontaminationen sein.

4. Zumindest der Testtisch sollte mit Wattebällchen mit 75 % Alkohol abgewischt werden.

5.Endogene RNase Alle Gewebe enthalten endogene Enzyme, daher ist das schnelle Einfrieren von Geweben mit flüssigem Stickstoff der beste Weg, den Abbau zu reduzieren.Die Lagerungs-/Zerkleinerungsmethode mit flüssigem Stickstoff ist in der Tat umständlich, aber für Gewebe mit einem hohen Anteil an endogenen Enzymen die einzige Möglichkeit.

6. RNA-Proben RNA-Extraktionsprodukte können Spuren von RNase-Kontamination enthalten.

7. Plasmidextraktion Bei der Plasmidextraktion wird häufig Rnase zum Abbau von RNA verwendet, und die verbleibende Rnase sollte mit Proteinase K verdaut und durch PCI extrahiert werden.

8. RNA-Lagerung Auch bei Lagerung bei niedrigen Temperaturen führen Spuren von RNase zum RNA-Abbau.Die beste Lösung für die Langzeitkonservierung von RNA ist eine Salz-/Alkohol-Suspension, da Alkohol bei niedrigen Temperaturen jegliche enzymatische Aktivität hemmt.

9. Wenn Kationen (Ca, Mg) diese Ionen enthalten, führt das Erhitzen auf 80 °C für 5 Minuten zur Spaltung der RNA. Wenn also die RNA erhitzt werden muss, muss die Konservierungslösung einen Chelatbildner (1 mM Natriumcitrat, pH 6,4) enthalten.

10. In nachfolgenden Experimenten verwendete Enzyme können durch RNase kontaminiert sein.

10 Tipps zur RNA-Extraktion

1: RNase-Aktivität schnell verhindern.Die Proben werden nach der Entnahme schnell eingefroren und RNase wird durch den schnellen Vorgang während der Lyse inaktiviert.

2: Wählen Sie eine geeignete Extraktionsmethode für Gewebe mit hohem Ribozymgehalt. Für Fettgewebe ist es am besten, die Methode mit Phenol zu verwenden.

3: Die Vorhersagequalität erfordert Northern, der Aufbau einer cDNA-Bibliothek erfordert eine hohe Integrität und RT-PCR und RPA (Ribonuklease-Schutzassay) erfordern keine hohe Integrität.RT-PCR erfordert eine hohe Reinheit (Enzym-Inhibitor-Rückstände).

4: Eine gründliche Homogenisierung ist der Schlüssel zur Verbesserung des Ertrags und zur Reduzierung des Qualitätsverlusts.

5: Überprüfen Sie die Integrität der RNA-Elektrophorese-Detektion. 28S: 18S = 2: 1 ist ein vollständiges Zeichen, 1: 1 ist für die meisten Experimente auch akzeptabel.

6: Entfernung von DNA für RT-PCR, Array-Analyse Zur DNA-Entfernung verwenden Sie am besten DNAse I.

7: Reduzieren Sie die Kontamination mit exogenen Enzymen – Enzyme können nicht von außen importiert werden.

8: Bei der Konzentration niedrig konzentrierter Nukleinsäure sollte ein Kopräzipitationsreagenz hinzugefügt werden.Aber um zu verhindern, dass das Mitfällungsmittel Enzyme und eine DNA-Kontamination enthält.

9: RNA gründlich auflösen, ggf. 5 Minuten auf 65 °C erhitzen.

geeignete Lagermethode

Es kann kurzzeitig bei –20 °C und längere Zeit bei –80 °C gelagert werden.Der erste Schritt zur Verbesserung der RNA-Ausbeuten besteht darin, zu erkennen, dass der RNA-Gehalt verschiedener Proben stark variiert.Hohe Häufigkeit (2-4 ug/mg) wie Leber, Bauchspeicheldrüse, Herz, mittlere Häufigkeit (0,05-2 ug/mg) wie Gehirn, Embryo, Niere, Lunge, Thymusdrüse, Eierstöcke, geringe Häufigkeit (<0,05 ug/mg) mg) wie Blase, Knochen, Fett.

1: Zellen lysieren, um RN freizusetzen – wenn keine RNA freigesetzt wird, verringert sich die Ausbeute.Die elektrische Homogenisierung funktioniert besser als andere Homogenisierungsmethoden, muss jedoch möglicherweise auch mit anderen Methoden kombiniert werden, z. B. dem Maischen mit flüssigem Stickstoff oder dem enzymatischen Aufschluss (Lysozym/Lyticase).

2: Optimierung der Extraktionsmethode.Die größten Probleme bei phenolbasierten Methoden sind unvollständige Stratifizierung und teilweiser RNA-Verlust (der Überstand kann nicht vollständig entfernt werden).Eine unvollständige Schichtung ist auf einen hohen Nukleinsäure- und Proteingehalt zurückzuführen, der durch eine Erhöhung der verwendeten Lysatmenge oder eine Reduzierung der Probenmenge behoben werden kann.Dem Fettgewebe wurde ein Schritt der Chloroformextraktion hinzugefügt.Der RNA-Verlust kann durch Rückpumpen oder durch Entfernen der organischen Schicht und anschließende Zentrifugation reduziert werden.Das größte Problem bei auf Säulenzentrifugation basierenden Methoden ist überschüssige Probe.

Klassische Extraktionstipps

1. Phenolreinigung: Geben Sie ein gleiches Volumen Phenol/Chloroform im Verhältnis 1:1 hinzu und mischen Sie 1–2 Minuten lang kräftig.2 Minuten lang bei hoher Geschwindigkeit zentrifugieren.Entfernen Sie vorsichtig den Überstand (80–90 %).Erreichen Sie niemals die mittlere Schicht.Ein gleiches Volumen der Reaktionslösung kann zu Phenol/Chloroform gegeben und der Überstand entfernt werden.Zur Verbesserung der Ausbeute können die beiden Überstände zur Nukleinsäurefällung miteinander vermischt werden.Gehen Sie beim Mischen nicht zu vorsichtig vor und versuchen Sie nicht, den gesamten Überstand zu entfernen.

2. Waschen mit 70–80 % Ethanol: Während des Waschens muss die Nukleinsäure suspendiert werden, um sicherzustellen, dass das restliche Salz weggespült wird.Gleichzeitig unmittelbar nach dem Abgießen des Ethanols einige Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit zentrifugieren und anschließend das restliche Ethanol mit einer Pipette entfernen.Nach 5-10-minütigem Stehen bei Raumtemperatur auflösen.

11. Extraktion spezieller Organisationen

1. Faseriges Gewebe: Der Schlüssel zur RNA-Extraktion aus faserigem Gewebe wie Herz-/Skelettmuskeln liegt in der vollständigen Zerstörung des Gewebes.Diese Gewebe haben eine geringe Zelldichte, sodass die Menge an RNA pro Gewichtseinheit Gewebe gering ist und es am besten ist, so viel Ausgangsmenge wie möglich zu verwenden.Stellen Sie sicher, dass Sie das Gewebe unter Gefrierbedingungen gründlich zermahlen.

2. Gewebe mit hohem Protein-/Fettgehalt: Der Gehirn-/Pflanzenfettgehalt ist hoch.Nach der PCI-Extraktion enthält der Überstand weiße Flocken.Der Überstand muss mit Chloroform erneut extrahiert werden.

3. Gewebe mit hohem Nukleinsäure-/Ribozymgehalt: Milz/Thymus haben einen hohen Nukleinsäure- und Ribozymgehalt.Durch Mahlen von Gewebe unter Gefrierbedingungen und anschließender schneller Homogenisierung können Ribozyme wirksam inaktiviert werden.Wenn das Lysat jedoch zu viskos ist (aufgrund des hohen Nukleinsäuregehalts), kann die PCI-Extraktion nicht effektiv schichten;Das Hinzufügen von mehr Lysat kann dieses Problem beheben.Durch mehrere PCI-Extraktionen kann mehr Rest-DNA entfernt werden.Wenn sich unmittelbar nach der Zugabe von Alkohol ein weißer Niederschlag bildet, deutet dies auf eine DNA-Kontamination hin.Eine erneute Extraktion mit saurem PCI nach der Auflösung kann DNA-Kontaminationen entfernen.

4. Pflanzengewebe: Pflanzengewebe ist komplexer als tierisches Gewebe.Im Allgemeinen werden Pflanzen unter Bedingungen von flüssigem Stickstoff gemahlen, sodass ein RNA-Abbau durch endogene Enzyme selten vorkommt.Wenn das Problem des Abbaus nicht behoben wird, liegt die Ursache mit ziemlicher Sicherheit in den in der Probe enthaltenen Verunreinigungen.Die in vielen Pflanzen enthaltenen Verunreinigungen führen zu Rückständen, und der Grund für Rückstände liegt oft darin, dass diese Verunreinigungen gewisse Ähnlichkeiten mit RNA aufweisen: Sie präzipitieren und ich präzipitiere, und Sie adsorbieren und ich adsorbiere.Diese Eigenschaften machen sie zu sehr starken Enzyminhibitoren.

Derzeit können kommerzielle RNA-Extraktionsreagenzien mit kleinen Anpassungen an fast alle tierischen Gewebe angepasst werden, es gibt jedoch nur wenige kommerzielle RNA-Extraktionsreagenzien, die für die meisten Pflanzengewebe geeignet sind.Glücklicherweise kann Foregene etwas Besonderes bietenPflanzen-RNA-Extraktionskits, wir habenKit für die Gesamt-RNA-Isolierung von Pflanzen, Plant Total RNA Isolation Kit Plus.Letzteres ist speziell für Pflanzen mit hohem Polysaccharid- und Polyphenolgehalt konzipiert.Für die RNA-Extraktion ist das Feedback der Labornutzer besonders gut.

12. Die Auswirkung des Einfrierens und Auftauens der Probe Die gefrorene Probe kann größer sein und muss vor der Verwendung für die RNA-Extraktion geschnitten werden.Proben neigen dazu, beim Schneiden (möglicherweise teilweise) zu schmelzen.Gefrorene Proben müssen möglicherweise vor der RNA-Extraktion gewogen werden, und während dieses Vorgangs kommt es auf jeden Fall zu einem Auftauen.Manchmal kommt es auch beim Mahlen mit flüssigem Stickstoff zum Auftauen der Probe;oder die gefrorene Probe wird ohne Mahlen mit flüssigem Stickstoff direkt zum Lysat gegeben, und das Auftauen erfolgt auf jeden Fall vor der vollständigen Homogenisierung.Experimente haben gezeigt, dass gefrorenes Gewebe beim Auftauen anfälliger für den RNA-Abbau ist als frisches Gewebe.Der wahrscheinliche Grund: Durch den Gefrier-Tau-Prozess werden Strukturen innerhalb der Zelle zerstört, wodurch endogene Enzyme leichter in direkten Kontakt mit der RNA kommen können.

13. Beurteilung der RNA-Qualität Normalerweise wird die Elektrophorese zur Beurteilung der Integrität der RNA und A260/A280 zur Beurteilung der Reinheit der RNA verwendet.Theoretisch hat intakte RNA ein Verhältnis von 28S:18S = 2,7:1, und die meisten Daten betonen das Verhältnis von 28S:18S = 2:1.Tatsache ist, dass fast keine der aus anderen Proben als Zellen extrahierten RNA im Verhältnis 2:1 vorliegt (dies wurde mit dem Agilent Bioanalyzer ermittelt).

Die Elektrophoreseergebnisse von RNA werden von vielen Faktoren beeinflusst, einschließlich Sekundärstruktur, Elektrophoresebedingungen, Probenbelastung, Sättigungsgrad durch EB usw. Verwenden Sie native Elektrophorese zum Nachweis von RNA und verwenden Sie DNA-Marker als Kontrolle.Wenn 28S bei 2 kb und 18S bei 0,9 kb klar sind und 28S: 18S > 1, kann die Integrität die Anforderungen der meisten nachfolgenden Experimente erfüllen.

A260/A280 ist ein Indikator, der für große Verwirrung gesorgt hat.Zunächst muss die ursprüngliche Bedeutung dieses Indikators für Nukleinsäuren geklärt werden: reine RNA, ihr A260/280 = etwa 2,0.Reine RNA ist die „Ursache“ und A260/A280 = 2 ist die „Wirkung“.Jetzt benutzt jeder A260/A280 als „Ursache“ und denkt: „Wenn A260/A280 = 2, dann ist RNA rein“, was natürlich zu Verwirrung führt.

Wenn Sie interessiert sind, können Sie Ihrer RNA-Probe ein wenig Reagenz hinzufügen, das häufig bei der Extraktion verwendet wird, wie z. B. Phenol, Guanidinisothiocyanat, PEG usw., und dann das A260/A280-Verhältnis messen.Die Realität ist, dass viele der für die RNA-Extraktion verwendeten Reagenzien sowie viele Verunreinigungen in der Probe etwa A260 und A280 absorbieren, was sich auf A260/A280 auswirkt.

Der derzeit aufschlussreichste Ansatz besteht darin, RNA-Proben im Bereich von 200–300 nm zu scannen.Die Kurve reiner RNA weist die folgenden Eigenschaften auf: Die Kurve ist glatt, A230 und A260 sind zwei Wendepunkte, A300 liegt nahe bei 0, A260/A280 = etwa 2,0 und A260/A230 = etwa 2,0.Wenn keine Scandaten verfügbar sind, muss auch das A260/A230-Verhältnis bestimmt werden, da dieses Verhältnis empfindlicher auf die Verschleppung aller Verunreinigungen reagiert, die die enzymatische Reaktion beeinflussen.Berücksichtigen Sie den linearen Bereich des Geräts (0,1–0,5 für A260).

Es gibt zwei weitere nützliche Phänomene: Das Verhältnis wird etwa 0,3 niedriger sein, wenn A260/A280 in Wasser gemessen wird;während das in 10 mM EDTA gemessene Verhältnis etwa 0,2 höher ist als das in 1 mM EDTA gemessene.

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